$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Murin oküler yüzey iltihabının indüksiyonu
- Bağışıklama için immünojen hazırlığı yapın.
- İmmünojeni bağışıklama gününde taze olarak hazırlayın, ovalbümin (OVA, 50 mg / mL) ve boğmaca toksini (100 μg / mL) salin ve adjuvan alüminyum hidroksit (40 mg / mL) (Malzeme Tablosuna bakınız) 1: 1 oranında.
Dikkat: Boğmaca toksininin açılmasını, sulandırılmasını ve immünojen hazırlanmasını laminer bir güvenlik kabininde gerçekleştirin. Koruyucu giysi giyin ve cilt ile herhangi bir temastan kaçının.
- İmmünojen ve adjuvan karışımını oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve 100 μL'yi 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.
- Anestezi uygulanmamış bir farede immünojen çözeltisinin intraperitoneal enjeksiyonunu gerçekleştirin.
- Kafes ızgarasını kavrarken fareyi kuyruğundan yumuşak bir şekilde tutun. Sırtın derisini ve boyun bölgesini başparmak ve işaret parmağı arasında sıkıca tutun ve yüzük ile küçük parmak arasındaki kuyruğu ve alt uzuvları elinizin avucuna sabitleyin.
- Sabit fareyi başı aşağı bakacak şekilde tutun.
- Hazırlanan immünojen çözeltisinden 100 μL'yi alt karın boşluğunun sağ veya sol çeyreğine enjekte edin.
- Bağışıklamadan 2 hafta sonra oküler yüzey taraması yapın.
- Fareyi izofluran (% 2.5) ile uyuşturun.
- Her iki göze 5 μL OVA (50 mg/mL) veya salin (% 0.9 NaCl) uygulayın ve damla göz tarafından emilene kadar bekleyin. Bu ~ 5 dakika sürer.
- İşlemi 7 gün boyunca günde 1 kez tekrarlayın.
not: İlaçların topikal uygulaması da aynı şekilde yapılabilir.
2. Oküler eksüdaların toplanması
- Meydan okumadan hemen sonra göze 50 μL steril salin uygulayarak meydan okuma aşamasında oluşan oküler eksüdaları geri kazanın.
3. Oküler yüzey dokularının eksizyonu
- Aşağıdaki adımları izleyerek göz kapaklarını ve göz küresini inceleyin.
- Fareyi CO2 asfiksi ve servikal çıkık ile ötenazi yapın.
- Fareyi düz bir yüzeye yerleştirin.
- Göz çevresindeki orbital alanı% 70 etanol ile emprenye edilmiş bir çubukla dezenfekte edin.
- Kulak ile retro-orbital sinüs arasında ve skuamöz kemiğin üzerindeki yüzey boyunca dikey olarak bir kesi yapın, kesiği yatay olarak alt göz kapağının altına, maksiller kemik boyunca ve ön kemik boyunca üst göz kapağının üzerine uzatın. Bu da göz çevresinde bir kesi oluşturur (Şekil 1).
- Kavisli forseps kullanarak diseke edilen dokuyu göz çevresinde dikkatlice tutun ve dokuyu ve göz küresini dışarı çekin.
- Eksize edilen organları steril PBS'ye yerleştirin.
- Eksize edilen üst göz kapaklarının etrafındaki fazla yüz kas dokusunu bir neşter kullanarak ve stereomikroskop altında kesin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek konjonktivayı toplayın.
- Üst göz kapağını stereomikroskop altında kuru bir Petri kabına yerleştirin.
- İnce cımbız ve neşter kullanarak, beyazımsı mukoza tabakasını göz kapağının iç yüzeyinden çok nazikçe soyun.
- Ardından, aşağıdaki adımları izleyerek korneayı inceleyin.
- Göz küresini 3 dakika boyunca kuru buzun üzerine yeni bir kuru Petri kabına yerleştirin.
- Petri kabını sabit bir pozisyonda tezgah yüzeyine alın.
- İnce keskin bir makas kullanarak korneanın kenarında, limbusun yanında küçük bir kesi yapın.
- Sklerayı korneadan ayırarak göz küresinin etrafındaki neşter ile kesiyi uzatın.
- İris ve lens kalıntılarını korneanın arka tarafından tuzlu su çözeltisi ile cömertçe yıkayarak çıkarın.
