$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kemik İliği Makrofaj Türevi ve Antikorlarla Aktivasyon
- CO2 boğulması kullanarak ötenazi gerçekleştirin.
- Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin. Fareyi% 5 izofluran anestezisi ile 60 - 90 saniye boyunca, hareketsiz kalana ve nefes almak derin ve yavaş olana kadar ötenazi yapın.
- İzofluran anestezisini kapatın ve fare nefes almayı bırakana kadar 6-8 L / dk CO2 uygulayın. CO2 ile fareyi en az 5 dakika daha açık bırakın. Artık kalp atışı veya solunum olmadığını doğrulayın. Ölümü sağlamak için servikal çıkık yapın.
NOT: 8 - 12 haftalık fareler en yüksek makrofaj verimini sağlar.
- Fare bacaklarına %70 etanol püskürtün ve kolları ve bacakları sırtüstü pozisyonda bir köpük levha üzerinde gergin olacak şekilde sabitleyin. Cildi tutmak için makas ve forseps ile, arka bacakların her birinin yüzeyinden cildi ve kürkü çıkarmak için sığ bir kesim (0,2 cm) yapın.
not: Bu prosedürü ve tüm doku kültürü manipülasyonlarını steril bir başlıkta gerçekleştirin.
- Kaval kemiği ve uyluk kemiğini görünür hale getirmek için kasları kesin. Kalça ekleminin hemen altındaki ve ayak bileklerinin üzerindeki kemik ve kasları keserek tibiaları ve femurları çıkarın. Mümkün olduğu kadar çok kas kesin.
- Kemiklere %70 etanol püskürtün ve buharlaşması için 1 dakika bekleyin, ardından bunları 6 oyuklu bir kemik yıkama ortamı plakasına yerleştirin (Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'nun ortamı (IMDM),% 10 fetal sığır serumu (FBS)).
- Kemik boşluğu açığa çıkacak şekilde ayak bileğinden ve uyluk kemiğinin üstünden 0,1 cm kemik keserek kemiklerin uçlarını kesin. İliğin görünür olduğundan ve kemik boşluğuna 26 gauge bir iğne yerleştirilebildiğinden emin olun.
- Tibiaları ve uyluk kemiğini diz eklemlerinden ayırmak için kemikleri ve kasları kesin. 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 26 gauge iğneyi boşluğa yerleştirin. Kemik iliğini 5 mL kemik yıkama ortamı ile 50 mL'lik konik bir tüpe yıkayın. Her 50 mL'lik tüpe bir fareden iki tibia ve iki uyluk kemiğini yıkayın.
- Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin veya topakları nazikçe dağıtmak için iliği yavaş bir hızda girdaplayın. Kemik iliği dizileri küçük (0,5 mm'den az) ilik lekelerine bölünmelidir. Konik tüpü kemik yıkama ortamı ile 50 mL'ye kadar doldurun. Konik tüpün içeriğini 75cm2'lik doku kültürü ile muamele edilmiş bir şişeye pipetleyin ve 37 ° C'de, 1 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe <>
not: Olgun makrofajlar ve mezenkimal hücreler şişeye yapışacak ve atılacak, istenen hematopoietik progenitörler süspansiyon halinde kalacaktır.
- Ortamı hematopoietik progenitörlerle 50 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin. Tüpü oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 5 mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) kültür ortamında (IMDM, %10 FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 150 μM monotiogliserol (MTG)) yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri 30 mL ortamda 0,5 x 106 hücre / mL, 1,5 x 107 hücre / şişe konsantrasyonuna yeniden süspanse etmek için ortam ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. 30 mL süspansiyonu 75cm2'lik yeni bir doku kültürü ile muamele edilmiş şişeye pipetleyin.
- Adım 1.9'daki ilk kültürden sonraki 4. ve 7. günlerde, ters faz kontrastlı parlak alan mikroskobu kullanarak hücrelerin yapışık ve hafifçe dallanmış olduğunu doğrulayın. Yapışmayan hücreleri içeren ortamı atın. Hücreleri IMDM ile bir kez yıkayın ve 30 mL MCSF kültür ortamı ekleyin.
- Hücreler 10. güne kadar olgunlaştığında (F4/80 ve Mac-1 için %>95 pozitif), hücrelerin yapışık ve hafif olduğunu tekrar doğrulayın.
- Hücreleri stimülasyon için plakalamak için, kültür ortamını şişeden çıkarın ve 8 mL enzim içermeyen, EDTA bazlı hücre ayrışma tamponu ekleyin (Malzeme Tablosu). Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de 5 dakika inkübe edin.
- Steril bir hücre sıyırıcı kullanarak hücreleri az miktarda basınçla nazikçe kazıyın. Mikroskopta hücrelerin şişe yüzeyinden ayrıldığını kontrol edin. Ayrışmış hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin. Şişeyi 5 mL IMDM ile 3 kez durulayın ve durulama solüsyonunu hasat edilen hücrelerle bir araya getirin. Hücreleri oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Hücre peletini 50 mL konik tüp başına 3 mL MCSF kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. 1 x 106 hücre / mL konsantrasyonda hücreleri yeniden süspanse edin ve 96 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş, düz tabanlı plakanın kuyusu başına 100 μL hücre süspansiyonu (1 x 105 hücre / kuyu) plakası.
not: Bir fareden alınan kemikler 100 kuyu için yeterli hücre üretecektir. İstenirse, 1 mL hücre 6 oyuklu bir plakada kaplanabilir (doku kültürü ile muamele edilmiş, düz dipli). Daha fazla sayıda hücre (1 x 10,6 hücre) western blot analizleri için yararlı olabilir.
- Yapıştıktan sonra, her biri IMDM'de 10 ng / mL LPS, 30 mg / mL IVIg veya IVIg + LPS ile çift veya üçlü kuyucukları uyarın. Yanıtları optimize etmek için LPS veya IVIg dozları titre edilebilir. Uyarılmamış kontroller olarak çift veya üçlü kuyucuklar bırakın. 24 saat (37 °C, %5 CO2) inkübe edin.
not: Yeniden kaplanan hücreler 1 saat içinde doku kültürü kuyucuklarına yapışmalıdır.
- Her bir kuyucuktan hücre süpernatantlarını ayrı ayrı 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın ve 5 dakika boyunca 10.000 x g'da döndürerek partikül maddeleri çıkarın.
- Hücre süpernatantını çıkarın ve peleti rahatsız etmekten kaçının. Arıtılmış hücre süpernatantını steril bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
not: Hücre süpernatantları, sitokinler, IL-10 ve sitokin alt birimi, IL-12 / 23p40 için enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile hemen test edilebilir veya -80 ° C'de uzun süreli olarak saklanabilir. Piyasada bulunan bir kitten (Malzeme Tablosu) ELISA protokolünü takip edin. IL-6 ve TNF gibi diğer pro-inflamatuar sitokinler test edilebilir, çünkü bunlar tek başına LPS ile stimülasyona kıyasla IVIg + LPS stimülasyonu ile birlikte tedavi ile de azaltılır. Stimülasyondan sonra, yapışık hücreler western blotlama veya kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (Q-PCR) gibi teknikler için hazırlanabilir.