Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. İntravenöz immünoglobulin ve lipopolisakkarit (IVIg+LPS) ile in vivo Zorlu Fareler ve Peritoneal Makrofajların Toplanması
- Her fareyi tartın. 2.5 g / kg vücut ağırlığında bir final dozu sağlamak için gereken IVIg hacmini (100 mg / mL stok konsantrasyonu) hesaplayın. 0.2 μg / g vücut ağırlığında bir nihai doz sağlamak için gereken LPS miktarını (Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'nun ortamında (IMDM) 100 μg / mL stok konsantrasyonu) hesaplayın.
not: Örneğin, 20 g'lık bir fare için 500 μL IVIg stok çözeltisi ve 40 μL 100 μg/mL LPS çözeltisi gereklidir.
- Gerekli miktarda IVIg ve LPS'yi steril 26 gauge iğne ile donatılmış steril 1 mL'lik bir şırıngaya çekin. IVIg almayacak kontrol fareleri için, eşdeğer bir IVIg hacmini steril fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 ile değiştirin.
- Başparmağınız ve işaret parmağınızla boynunun arkasındaki derisini kavrayarak ve kalan parmaklarınızla kuyruğunu ve arka bacaklarını tutarak fareyi bir elinizle tırnağa vurun. Vücudunu yere doğru eğin.
- İğneyi farenin karnına göre 30 - 40° açıyla, sağ alt kadrana yerleştirin, eğim verin ve 1,5 cm yerleştirin. IVIg + LPS veya PBS + LPS'yi intraperitoneal olarak enjekte edin.
- 1 saat sonra, karbondioksit (CO2) boğulması kullanarak ötenazi yapın.
- Fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin. Fareyi% 5 izofluran anestezisi ile 60 - 90 saniye boyunca, hareketsiz kalana ve nefes almak derin ve yavaş olana kadar ötenazi yapın.
- İzofluran anestezisini kapatın ve fare nefes almayı bırakana kadar 6-8 L / dk CO2 uygulayın. CO2 ile fareyi en az 5 dakika daha açık bırakın. Artık kalp atışı veya solunum olmadığını doğrulayın. Ölümü sağlamak için servikal çıkık yapın.
NOT: 8 - 12 haftalık fareler en yüksek makrofaj verimini sağlar.
- Fareyi, uzuvları yayılmış bir köpük tahtaya sabitleyin. Parçalara %70 etanol püskürtün.
not: İşlemi steril bir başlıkta gerçekleştirin.
- Periton boşluğunun kesilmesini önlemek için farenin orta hattı boyunca makasla deride (0,2 cm) sığ bir kesim yapın. Karın derisini forseps kullanarak farenin karnından çekin, böylece sağlam periton duvarının astarı görünür hale gelir.
- 5 mL'lik bir şırıngayı 5 mL steril PBS (pH 7.4) ile doldurun. 25 veya 27 gauge bir iğneyi, iğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde sol veya sağ taraftan farenin merkezine doğru boşluğun üst kısmına sokun.
not: İğneyi fareye dikkatlice yerleştirin, böylece PBS'yi organlara değil, periton boşluğuna enjekte etmeyin.
- Sıvıyı periton boşluğuna itin. İğneyi boşluktan dışarı çekin ve herhangi bir hücreyi çıkarmak için peritona 10 saniye boyunca masaj yapın. İğneyi boşluğun üstüne yerleştirin ve organlardan kaçının. Geri kazanılan lavaj sıvısını toplayın ve buz üzerinde 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
not: Enjekte edilen her 5 mL sıvı için yaklaşık 3.75 mL geri kazanılacaktır.
- Toplamda 15 mL lavaj sıvısını geri kazanmak için enjeksiyonu ve geri kazanımı (aşama 1.8 - 1.9) 3 kez daha (toplam enjeksiyon hacmi 20 mL) tekrarlayın. Her fareden lavajı ayrı bir 15 mL konik tüpe toplayın.
not: Son enjeksiyondan sonra, sıvının biriktiği farenin en sol ve sağ taraflarından sıvıyı çıkarmak daha kolay olabilir. Organlar bu pozisyonda iğne ile daha az etkileşime neden olacaktır.
- Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün. 1 mL geri kazanılmış lavaj sıvısını çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile interlökin veya IL-10 ve IL-12 / 23p40 analizleri için kullanın veya gelecekteki analizler için -80 ° C'de dondurun.
not: Lavaj sıvısı sitokin analizi için tedaviler arasında doğru karşılaştırmayı sağlamak için, 15 mL'lik bir son hacim için periton boşluğunun 5 mL yıkamasını 4 kez gerçekleştirin. Her yıkamadan tüm sıvı geri kazanılmayacaktır.
- Hücreleri, yıkanan fare başına 500 μL kaplama ortamında (IMDM,% 10 fetal sığır serumu, FBS ve 100 U / mL penisilin / streptomisin) yeniden süspanse edin. Canlı makrofajları sayın.
not: Makrofajlar diğer periton hücrelerinden biraz daha büyük olacaktır. Tipik verim 5 x 105 - 1 x 106 makrofaj/fare vahşi tip C57BL/6 faredir.
opsiyonel: Hücre peletinde çok sayıda kırmızı kan hücresi varsa, bunları çıkarmak için üreticinin talimatlarına göre bir lizis adımı gerçekleştirin.
- Kaplama ortamındaki hücreleri 1 x 106 makrofaj / mL'de yeniden süspanse edin ve 96 oyuklu düz tabanlı doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakada kuyu başına 100 μL plaka.
not: Bir deney için birden fazla fareden alınan hücrelerin bir araya getirilmesi gerekebilir. Örneğin, bir farede 5 x 105 makrofaj varsa, 500 μL kaplama ortamı gerekli olacaktır.
- Makrofajların yapışmasını sağlamak için hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin. Yapışık hücreler peritoneal makrofajlardır. Hücre süpernatantlarını ve yapışık olmayan hücreleri çıkarın. Kuyuları 200 μL IMDM (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ile iki kez durulayın, 10 saniye bekleyin ve plakayı yavaşça eğin. Kaplama ortamını değiştirin. Hücreleri stimülasyondan önce 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin.
- Yapıştıktan sonra, her biri IMDM'de 10 ng / mL LPS, 30 mg / mL IVIg veya IVIg + LPS ile çift veya üçlü kuyucukları uyarın. Yanıtları optimize etmek için LPS veya IVIg dozları titre edilebilir. Uyarılmamış kontroller olarak çift veya üçlü kuyucuklar bırakın. 24 saat (37 °C, %5 CO2) inkübe edin.
not: Yeniden kaplanan hücreler 1 saat içinde doku kültürü kuyucuklarına yapışmalıdır. Numuneler hemen kullanılabilir veya dondurulabilir ve ELISA ile sitokin analizi için -80 °C'de saklanabilir.
- Her bir kuyucuktan hücre süpernatantlarını ayrı ayrı 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın ve 5 dakika boyunca 10.000 x g'da döndürerek partikül maddeleri çıkarın.
- Hücre süpernatantını çıkarın ve peleti rahatsız etmekten kaçının. Arıtılmış hücre süpernatantını steril bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
not: Hücre süpernatantları, sitokinler, IL-10 ve sitokin alt birimi, IL-12 / 23p40 için ELISA ile hemen test edilebilir veya -80 ° C'de uzun süreli olarak saklanabilir. Piyasada bulunan kitten (Malzeme Tablosu) ELISA protokolünü takip edin. IL-6 ve tümör nekroz faktörü (TNF) gibi diğer pro-inflamatuar sitokinler, tek başına LPS ile stimülasyona kıyasla IVIg + LPS stimülasyonu ile birlikte tedavi ile azaltıldıkları için test edilebilir. Stimülasyondan sonra, yapışık hücreler western blotlama veya kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (Q-PCR) gibi teknikler için hazırlanabilir.
