Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Farelerin Bağışıklanması
- Salin veya DPS gibi steril bir fizyolojik tamponda bir ana aşı karışımı hazırlayın.
not: Karışımdaki toplam hacim, tüm grubun aşılanması için gerekenden %10 daha fazlasını içermelidir. Aşı bileşiminin konsantrasyonları aşağıda 1.1.1 ve 1.1.2 adımlarında detaylandırılmıştır. Eşyaları buz üzerindeki vivaryuma taşıyın.
- B. pertussis çalışmaları için aşağıdaki aşı gruplarını içerir: aselüler boğmaca aşısı (aPV) ve aPV + Bordetella kolonizasyon faktörü A (BcfA). Ek olarak, şap, tek başına aşı antijenleri (filamentli hemaglutinin (FHA) ve pertaktin (Prn)) ve kontrol grupları olarak saf (aşılanmamış) fareler kullanın.
NOT: aPV, tetanoz tokSOIDI, indirgenmiş difteri tokSOIDI, boğmaca tokSOIDI (PT), filamentli hemaglutinin (FHA) ve alüminyum tuzlarına adsorbe edilmiş pertaktinden (Prn) oluşan FDA onaylı bir aPV'nin insan dozunun 1/5'idir. Mevcut boğmaca aPV'nin bir insan dozu 0.5 mL'dir, bu nedenle birdozun 1 / 5'i 0.1 mL'dir. aPV + BcfA hacimleri, fare başına 0.1 mL aPV (insan dozunun 1/5'i) + 0.046 mL BcfA'dır (30 μg). Bir kasa güvenli bir şekilde verilebilecek maksimum hacim 0.1 mL'dir. aPV + BcfA aşı hacmi 0.1 mL'den büyük olduğundan, aşının güvenli bir şekilde uygulanabilmesi için her iki omuza da kabaca eşit olarak bölünmesi gerekir.
- Deneysel bir aşı hazırlamak için, bir doz için 1 μg FHA ve 0.5 μg Prn'yi steril PBS'de 50 μg alüminyum hidroksit jeli ile birleştirin. Deneysel aPV'nin oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca bir laboratuvar silindiri üzerinde karışmasına izin verin. Daha sonra, tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 18.000 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın ve içeriği 1 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin.
- Vivaryumda anestezi makinesini kurun (Şekil 1).
not: Kullanmadan önce ilgili tanklarında yeterli düzeyde oksijen ve izofluran olduğundan emin olun. İzofluran çöpçü teneke kutusunu tartın ve ağırlığı 50 g arttığında değiştirin.
- Biyolojik güvenlik kabinini (BSC) iyice temizleyin ve temiz indüksiyon odasını BSC'nin içine yerleştirin. Anestezi makinesinden gelen anestezi ve çöpçü hatlarını indüksiyon odasına bağlayın. Oksijenin aktığından emin olmak için oksijen tankını regülatör aracılığıyla açın ve seviyeyi 1.5-2 L/dk'ya ayarlayın.
- İstenilen yaştaki (6-12 hafta) fareleri indüksiyon odasına yerleştirin. Fareleri hafifçe uyuşturmak için izofluranı% 2.5-3'e getirin. Hayvanları odada hareket etmeyene ve solunumları yavaşlayana kadar izleyin.
- Herhangi bir refleksif hareket olup olmadığını gözlemleyerek ayak parmağınızı sıkıştırarak indüksiyon seviyesini test edin. Hiçbiri yoksa, fareler enjekte etmeye hazırdır.
NOT: Bu deneyde, tüm hayvan kafesi aynı anda uyuşturulmuştur. Hayvanları enjeksiyon için tek tek uyuşturmayı veya hayvanları anestezi olmadan enjekte etmeyi seçebilirsiniz. Bu yöntemlerden herhangi biri uygundur.
- Bu arada, her biri 0.1 mL aşı ile 1 mL insülin şırıngaları (28G1 / 2) hazırlayın. Hayvanlar tamamen indüklendiğinde, bir hayvanı odadan çıkarın ve fareyi ventral olarak bir havlu veya tezgah pedi üzerine koyun.
- Aşıyı kas içine uygulayın. Şırınga 45° açıyla ve eğim yukarı bakacak şekilde, şırıngayı farenin deltoidine ~5 mm yerleştirin ve aşıyı enjekte edin.
not: Arka çeyrek / kanat, deltoid yerine bir enjeksiyon bölgesi olarak kullanılabilir.
- Enjeksiyondan sonra, iğneyi kas içine sokulmuş halde ~ 5-10 saniye tutun. Hacim verildikten sonra, şırıngayı 180° döndürün, böylece bir sızdırmazlık oluşturmak ve aşının sızmasını önlemek için eğim dışarı bakacak şekilde çevirin. Ardından, iğneyi enjeksiyon bölgesinden yavaşça dışarı çekin.
- Fareyi kafese geri koyun. Prosedürü belirlenen gruptaki tüm hayvanlarla tekrarlayın.
- İzofluranı kapatın ve bir sonraki fare kafesini uyuşturmadan önce indüksiyon odasını oksijenle yıkayın.
- Hayvanları, hepsi uyanık olana ve kafeste hareket edene kadar izleyin. Kafesi muhafaza yerine geri koyun.
- Aşılamadan sonra her 12 saatte bir, 48 saate kadar, pürüzlü/dağınık tüy, yavaş yürüyüş veya zor nefes alma gibi klinik morbidite semptomları açısından hayvanları izleyin. Semptomlar devam ederse, kurumsal veterinerle görüşün ve gerekirse fareleri çalışmadan çıkarın.
- İlk bağışıklamadan dört hafta sonra, daha önce verilen aynı aşı formülasyonu ile farenin sağ deltoidine kas içi enjeksiyonları uyuşturarak ve uygulayarak fareleri güçlendirin.
- Yine, hayvanı herhangi bir klinik semptom açısından izleyin. Hayvanları 2 hafta daha barındırın ve ardından enfeksiyona devam edin.
2. Murin İntranazal Enfeksiyon Modeli
- Vivaryumda, oksijen ve anestezi koşullarını adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi ayarlayın. Adım 1.5'te açıklandığı gibi, fareleri uyuşturmak için odaya yerleştirin. Anestezi etkili olana kadar hayvanları izleyin.
- Fareler uyuşturulduğunda, indüksiyon odasından her seferinde bir hayvanı çıkarın. Fareyi dorsal toraksın tırnağından, omuz bıçaklarının ve boynun arkasından alın. Buruna erişmek için fareyi dik olarak konumlandırın.
- 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, farenin burunlarına 40-50 μL B. pertussis bakteri aşısını yavaşça uygulayın (her narede 20-25 μL). Tüm aşı hayvan tarafından solunana kadar fareyi tutun. İnokulumun bir kısmı köpürürse, kabarcıkları toplayın ve burunlara yeniden aşılayın. Negatif kontrol olarak bir grup fareye eşit miktarda steril PBS verin.
- Adım 1.10-1.12'de yapıldığı gibi, aşılanmış hayvanları kafeslerine geri koyun ve hayvanları uyanık ve hareket edene kadar izleyin. Kafesi raftaki orijinal yuvasına geri koyun. Bir sonraki hayvan grubunu uyuşturmadan önce kalan izofluranı çıkarmak için indüksiyon odasını oksijenle yıkayın. Hayvanları enfeksiyondan sonraki 48 saat boyunca izleyin.
- Laboratuvarda, farelere verilen gerçek koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) doğrulamak için steril PBS'de inokulumun plaka seri seyreltmeleri. %10 BG + Sm plakalarında 0.1 mL seyreltme plakası (%10 defibrine koyun kanı ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş Bordet-Gengou agar plakaları) (Şekil 2A). Plakaları 37 °C inkübatöre yerleştirin ve 4 gün boyunca büyütün. Fareye verilen aşıdan CFU'ları sayın ve hesaplayın (Şekil 2B).
3. Enfeksiyon Sonrası Hayvan Dokusunun Toplanması
- Fare diseksiyonu ve doku hasadı için hazırlanın.
- Bir otoklavda dokuları işlemek için gereken tüm aletleri (kaba ve ince makaslar, kavisli makaslar, ince forsepsler, pelet tokmakları ve üçgen yayıcılar) sterilize edin. Aletleri sterilizasyon poşetlerine kapatın. Cam dounce homojenizatörlerini folyoya sarın ve steriliteyi belirtmek için otoklav bandı ekleyin.
- Kullanmadan önce plakaların katılaştığından emin olmak için doku alımından 1 veya 2 gün önce agar plakaları hazırlayın. B. pertussis için,% 10 BG + Sm. Her deney için ampirik olarak belirlenen, istenen seyreltmelere sahip her fare için akciğer için etiket plakaları.
- CFU seyreltme tüplerini doldurun ve etiketleyin. İşlenecek organ sayısına ve organ başına seyreltmelere bağlı olarak steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine 0.9 mL steril PBS ekleyin.
- Doku toplama için tüpleri doldurun ve etiketleyin:
- Akciğerler: PBS'de steril 15 mL'lik konik bir tüpe 2 mL steril% 1 kazein ekleyin ve 4 ° C'de saklayın. Histoloji için akciğerleri hasat etmek için 2 mL% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) ekleyin ve RT'de saklayın.
- Diseksiyon için beherleri ve sprey şişelerini doldurmak için taze% 70 etanol hazırlanmalıdır.
- Hasat gününde tüm malzemeleri bir araba üzerinde vivaryuma taşıyın. BSC'yi temizleyin ve anestezi makinesini adım 1.3 ve 1.4'teki gibi ayarlayın.
- Diseke edilecek fareleri indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijen akışı ile izofluranı% 5'e getirin ve hayvanlar bilinçsiz olana kadar bekleyin. Fareleri birer birer çıkarın ve ölümü sağlamak için ikincil bir yöntem olarak hayvanı servikal olarak yerinden çıkarın. Servikal çıkığı takiben, ötenazi, solunum hızının olmaması ve / veya geri çekilme refleksinin olmaması (ayak parmağı sıkıştırma testi) ile doğrulanmalıdır.
- Fareyi ventral tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon tahtasına yerleştirin ve kolları ve bacakları sabitleyin. Farenin vücuduna% 70 etanol püskürtün.
- Forseps kullanarak, pelvisin ortasındaki cildi karnın altında sıkıştırın. Keskin bir makas kullanarak, mandibulaya kadar dikey bir kesim yapın. Ardından, makas kapalıyken küçük hareketler kullanarak iki katmanı birbirinden iterek cildi periton duvarından uzaklaştırın. Steril organ hasadı için engelsiz bir alan oluşturmak için deriyi karkasın yanlarına yerleştirin.
- Ksifoid işleminde göğüs kafesini stabilize etmek için forseps kullanın ve diyaframı kesin. Akciğerler sönmeli ve omurgaya doğru düşmelidir. Göğüs plakasını çıkarmak için göğüs kafesini yanlardan kesin.
- Pulmoner arterleri ve damarları keserek sağ akciğerin üst lobunu izole edin ve çıkarın. Lob'u %10 NBF içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve dokuyu sabitlemek için tüpü en az 24 saat RT'de yerleştirin. Sağ akciğerin ve sol akciğerin kalan loblarını izole edin. Lobları PBS'de 2 mL% 1 kazein içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin.
- Karkası biyolojik tehlike torbasına atın. Bir sonraki hayvanı incelemeden önce, aletleri deiyonize suyla durulayın ve ardından% 70 etanol ile doldurulmuş bir behere yerleştirin. Aletleri çıkarın, fazla etanolü silkeleyin ve ardından bir sonraki diseksiyona devam edin.
- Yukarıda belirtilen adımları izleyerek her fareyi inceleyin.
- Dokuları aşağıda anlatıldığı gibi işleyin.
4. Akciğerlerin İşlenmesi
- Akciğerleri (PBS'de 2 mL %1 kazein cinsinden) steril, 15 mL Dounce homojenizatöre aktarın. Dokuyu homojenize etmek için bir havaneli kullanın. Büyük doku parçacıkları kalmayana kadar ayrışır. Homojenize süspansiyonu orijinal 15 mL'lik tüpe geri yerleştirin.
- CFU'ları kaplamak için 0,3 mL'lik bir alikotu çıkarın ve homojenatı 450 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı 0,5 mL'lik alikotlarda toplayın ve önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine alın. Numuneleri ELISA ile sitokinlerin analizine kadar -20 °C'de saklayın.
- Homojenize akciğer süspansiyonunun 0.1 mL'sini seyreltme tüplerinde (0.9 mL steril PBS) seri olarak seyrelterek seçilen seyreltmeleri hazırlayın. Ampirik olarak seçilmiş 0.1 mL seyreltmeyi önceden etiketlenmiş %10 BG + Sm plakalarına plakalayın ve steril bir üçgen yayıcı kullanarak yayın.
- Plakaları 37 °C'de oda havasında 4 gün boyunca inkübe edin.
- CFU'ları/akciğerleri sayın ve hesaplayın (Şekil 3). Kısaca, geri kazanılan CFU sayılarını plakanın seyreltme faktörü ile, daha sonra da organın işlendiği toplam hacim ile çarpın. CFU hesaplamaları daha sonra her hayvan için Log10 değerlerine dönüştürülür ve grafiklendirilir.
- 30-300 kolonili plakalar kolay ve doğru bir şekilde sayılır. 6'dan az koloniye sahip plakalar hesaplamalar için kullanılmamalıdır, çünkü bu kadar düşük koloni sayıları hatalara neden olur. Daha düşük bir tespit limiti elde etmek için, bir organın homojenize edildiği toplam hacim, seyreltilmemiş homojenattan bir plaka üzerine lekelenmek için kullanılan hacme bölünür (örneğin, 2 mL toplam hacim bölü 0.1 mL seyreltilmemiş homojenat, tespit edilebilir 20 CFU'luk alt sınıra eşittir).
