NOT: Aşağıdaki adımlar IIA1.6 B hücreleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
1. Antijen kaplı boncuklarla B hücresi aktivasyonu
- Antijen kaplı boncukların hazırlanması
- B hücrelerini aktive etmek için, aktive edici (BCR-ligand+) veya aktive olmayan (BCR-ligand-) antijenlerle 50 μL (~ 20 x 106 boncuk) 3 μm NH 2-boncuk kullanılarak hazırlanan antijenle kovalent olarak kaplanmış NH2-boncuklar (Ag kaplı boncuklar) kullanın.
- IIA1.6 B hücreleri için BCR-ligand+ olarak anti-IgG-F(ab')2 fragmanı ve BCR-ligand- olarak anti-IgM-F(ab')2 veya sığır serum albümini (BSA) kullanır. Birincil B hücrelerini veya IgM + B hücre hattını aktive etmek için, BCR-ligand+ olarak anti-IgM-F (ab')2 ve BCR-ligand-.
not: Ligandların Fc reseptörüne bağlanmasını önlemek için, tam uzunlukta antikorlar yerine F(ab') veya F(ab')2 antikor fragmanları kullanın.
- Ag kaplı boncukların hazırlanmasına devam etmek için, numune manipülasyonu sırasında boncukların geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için boncukları düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Boncukları yıkamak için 1 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
- NH2 gruplarını aktive etmek için boncukları 500 μL %8 glutaraldehit ile yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında (RT) 4 saat döndürün.
Dikkat: Gluteraldehit stok çözeltisi yalnızca kimyasal çeker ocakta kullanılmalıdır. Malzeme güvenlik bilgi formundaki (MSDS) talimatları izleyin.
- Boncukları 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, glutaraldehiti çıkarın ve boncukları 1 mL 1x PBS ile üç kez daha yıkayın.
Dikkat: Gluteraldehit çözeltisi tehlikeli kimyasal atık olarak atılmalıdır.
- Aktive edilmiş boncukları 100 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Numune, iki düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne ayrılabilir: BCR-ligand+ için 50 μL ve BCR-ligand- için 50 μL.
- Antijen çözeltisini hazırlamak için, 150 μL PBS'de 100 μg/mL antijen çözeltisi içeren iki adet 2 mL'lik düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpü kullanın: Bir tüp BCR-ligand+ ve diğeri BCR-ligand-
.
- 150 μL antijen çözeltisi, vorteks içeren her tüpe 50 μL aktif boncuk çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de döndürün.
- Boncuklar üzerinde kalan reaktif NH2 gruplarını bloke etmek için 500 μL 10 mg / mL BSA ekleyin ve 4 ° C'de 1 saat döndürün.
- Boncukları 16.000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları üç kez daha soğuk 1x PBS ile yıkayın.
- Aktive edilmiş boncukları 70 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
- Ag kaplı boncukların nihai konsantrasyonunu belirlemek için, küçük bir hacimdeki boncukları PBS'de (1:200) seyreltin ve bir hemositometre kullanarak sayın. Daha sonra kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
not: Ag kaplı boncuklar 1 aydan fazla saklanmamalıdır.
>2. Poli-L-lizin lamellerin hazırlanması
- Ag kaplı boncuklarla B hücresi aktivasyon testinden önce, poli-L-lizin kaplı lameller (PLL-lameller) hazırlayın. 40 mL% 0.01 w / v PLL çözeltisi içeren 50 mL'lik bir tüp kullanın ve 12 mm çapındaki lamelleri çözeltiye daldırın. Gece boyunca RT'de döndürün.
- Lamelleri 1x PBS ile yıkayın ve parafin film ile kaplı 24 oyuklu bir plaka kapağında kurumaya bırakın. B hücresi aktivasyonu ile devam edin.
3. B hücresi aktivasyonu
- Boncuklarla B hücresi aktivasyonunu başlatmak için, önce IIA1.6 B hücre hattını CLICK ortamında 1.5 x 106 hücre / mL'ye seyreltin (2 mM L-Alanin-L-Glutamin + 55 μM beta-merkaptoetanol + 1 mM piruvat + 100 U/mL Penisilin + 100 μg/mL streptomisin) +% 5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu [FBS]).
- 100 μL (150.000 hücre) IIA1.6 B hücresini 0.6 mL tüplerde 1: 1 oranında Ag kaplı boncuklarla birleştirin. Bir girdap kullanarak hafifçe karıştırın ve PLL lamellerin üzerine tohumlayın. Bir hücre kültürü inkübatöründe farklı zaman noktaları için inkübe edin (37 °C /% 5 CO2). Tipik etkinleştirme zaman noktaları 0, 30, 60 ve 120 dakikadır. 0 zamanı için, PLL lamellerini buz üzerindeki 24 oyuklu plaka kapağına yerleştirin. Hücre-Ag kaplı boncuk karışımını ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
not: Yukarı ve aşağı pipetlemek yerine girdapla karıştırmak önemlidir çünkü bu, pipetin plastik ucunda birikmeleri nedeniyle numunedeki boncuk sayısını azaltabilir. Her test için negatif kontrol olarak BCR-ligand- ile kaplanmış boncuklar kullanın. Önce en uzun kuluçka süresini ve ardından sonraki zaman noktalarını etkinleştirmenizi öneririz. Numuneler için aktivasyon aralıklarını, aynı anda fiksasyona hazır olacak şekilde hesaplayın.
- Aktivasyonu durdurmak ve immünofloresan protokolüne devam etmek için her lamel için 100 μL soğuk 1x PBS ekleyin.
