Antijen Kaplı Bir Lamel Üzerinde B Hücresi Aktivasyonu

Özet

Kaynak: Ibañez-Vega, J., et al., İmmün Sinaps Oluşumu Sırasında B Hücrelerinde Organel Dinamiğinin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, in vitro olarak B hücresi aktivasyonunu göstermektedir. İşlem, B hücresi reseptörleri ile antijen etkileşimini içerir, bu da hücre iskeletinin yeniden şekillenmesine, immün sinaps oluşumuna, lizozom hareketine, antijen içselleştirmesine, işlenmesine ve ardından B hücresi aktivasyonu için MHC molekülleri üzerinde sunuma yol açar.

Protokol

1. Poli-L-lizin lamellerin hazırlanması

1. Ag kaplı boncuklarla B hücresi aktivasyon testinden önce, poli-L-lizin kaplı lameller (PLL-lameller) hazırlayın. 40 mL% 0.01 w / v PLL çözeltisi içeren 50 mL'lik bir tüp kullanın ve 12 mm çapındaki lamelleri çözeltiye daldırın. Gece boyunca RT'de döndürün.
2. Lamelleri 1xPBS ile yıkayın ve parafin filmi ile kaplı 24 oyuklu bir plaka kapağında kurumaya bırakın. B hücresi aktivasyonu ile devam edin.

2. Antijen kaplı lamellerde B hücresi aktivasyonu

1. Antijen kaplı lamellerin hazırlanması
   1. Aktivasyondan önce, antijen çözeltisini hazırlayın (10 μg/mL BCR-ligand+ ve 0.5 μg/mL sıçan anti-fare CD45R/B220 içeren 1x PBS).
   2. NOT: Lamelleri tahlilden bir gün önce hazırlamayı düşünün. B220, B hücresi yapışmasını iyileştirir, ancak BCR-Ligand+ yayılma tepkisini oluşturmak için yeterlidir.
   3. 12 mm'lik lamel parafin film ile kaplı 24 oyuklu bir plaka kapağına yerleştirin, her lamel üzerine 40 μL antijen çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Antijen çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için plakayı kapatın.
   4. Lamelleri 1x PBS ile yıkayın ve havayla kurutun.
2. B hücresi aktivasyonu
   1. Aktivasyonu başlatmak için, IIA1.6 B hücrelerini CLICK ortamı +% 5 FBS'de 1.5 x 10⁶ hücre / mL'ye seyreltin.
   2. Antijen kaplı bir lamel (Ag-lamelli) üzerine 100 μL hücre ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO_2'de bir hücre inkübatöründe farklı zaman noktaları için etkinleştirin. Tipik etkinleştirme zaman noktaları 0, 30 ve 60 dk.
      'dir not: Bölüm 1'de olduğu gibi, tüm örnekleri aynı anda sabitlemek için en uzun etkinleştirme zaman noktasıyla başlamanızı öneririz.
   3. 0 zamanı için, Ag-lamel içeren 24 oyuklu plaka kapağını buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
   4. Ortamı her bir Ag-lamel üzerinde dikkatlice aspire edin ve ardından aktivasyonu durdurmak için 100 μL soğuk 1x PBS ekleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
IIA1.6 (A20 varyantı) fare B-lenfoma hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	TİB-208	Yüzeyinde FcγIIR olmadan IgG içeren bir BCR eksprese eden Balb/c kökenli Murin B hücreli lenfoma
CaCl2	göz kırpan	CA-0520
glisin	göz kırpan	BM-0820
HyClone Fetal sığır serumu	Thermo Fisher Bilimsel	SH30071,03	56 ° C'de 30 dakika boyunca ısıtın
Kartal	göz kırpan	PO-1260
NaCl (Doğal)	göz kırpan	SO-1455
Parafilm Filmi	M	P1150-2
Penisilin-Streptomisin	Thermo Fisher Bilimsel	15140122	sıvı
Poli-L-Lizin	Sigma	P8920 Serisi	Steril su ile seyreltin
dev/dak-1640 dev/dak	Biyolojik Endüstriler	01-104-1A
Sodyum piruvat	Thermo Fisher Bilimsel	11360070
Tüp 50 ml	Corning	353043
2-merkaptoetanol	Thermo Fisher Bilimsel	21985023
Glutamine	Thermo Fisher Bilimsel	35050061
Keçi anti-fare IgG antikoru	Jackson İmmün Araştırma	315-005-003	IIA1.6 pozitif ligand

Serisi Serisi Serisi Serisi