Anti C-fms Antikorunun Fare Kemik İliği Hücrelerinde Osteoklastogenez Üzerine Etkisi İn Vitro

Özet

Kaynak: Marahleh, A., et al. Anti-c-fms Antikorunun Osteoklast Oluşumu ve Osteoklast Prekürsörünün İn Vitro Proliferasyonu Üzerine Etkisi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, farklı anti-c-fms antikor konsantrasyonlarının, osteoklast progenitörlerinden osteoklast oluşum süreci olan osteoklastogenez üzerindeki etkisini gösteriyoruz.

Protokol

1. BMM Üretimi

1. 10 cm'lik bir kültür kabına 1 x 10⁷ hücre / 10 mL tohumlayın ve M-CSF 100 ng / mL ekleyin. M-CSF'nin nihai konsantrasyonu 100 ng/mL kültür ortamıdır. Kültürü 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 3 gün boyunca inkübe edin.
2. 3 gün sonra, kültür ortamını çıkarın, yapışmayan hücreleri çıkarmak için hücreleri iki kez 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile kuvvetlice yıkayın, PBS'de 5 mL oda sıcaklığında% 0.02 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO₂ 5 dakika inkübe edin.
3. Kapsamlı pipetleme ile hücreleri ayırın. Kültürü mikroskop altında gözlemleyerek hücrelerin ayrıldığından emin olun (hücreler yuvarlak ve ortamda yüzer görünmelidir). Hücreler bağlı kalırsa, onları ayırmak için pipetlemeyi iyice tekrarlayın. Hücreler ayrıldığında, reaksiyonu etkisiz hale getirmek için 5 mL α-MEM ekleyin.
4. Hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve 5 mL α-MEM ile yıkayın.
5. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve peleti 10 mL α-MEM içinde yeniden süspanse edin.
6. Hücre sayımı gerçekleştirin.
7. 10 cm'lik bir kültür kabında 1 x 10⁶ hücre / 10 mL tohumlayın ve M-CSF 100 ng / mL ekleyin. M-CSF'nin nihai konsantrasyonu 100 ng/mL kültür ortamıdır. Kültürü 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 3 gün boyunca inkübe edin.

2. Osteoklast Öncüleri Olarak BMM'den Osteoklastların Üretilmesi

1. 3 gün sonra, 1.2-1.7 adımlarını izleyerek BMM'yi osteoklast öncüleri olarak temsil eden bağlı hücreleri hasat edin.
2. 96 oyuklu bir plakada 5 x 10⁴ hücre / 200 μL α-MEM'de tohum BMM'si. 50 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyon için RANKL veya 100 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyon için TNF-α ekleyin. Her kuyucuğa 100 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyon için M-CSF ekleyin.
3. Her oyuğa anti-c-fms antikoru (0, 1, 10, 100, 1000 ng / mL'lik nihai konsantrasyonlar) ekleyin.
4. 37 °C'de,% 5 CO_2'de 4 gün inkübe edin. 4 gün boyunca her gün medyayı değiştirin.

3. Tartarat Dirençli Asit Fosfataz (TRAP) Lekesi

1. 4 günlük inkübasyondan sonra, her bir oyuğun kültür ortamını nazikçe aspire edin. Her kuyuyu 200 μL oda sıcaklığında 1x PBS ile bir kez yıkayın.
2. Fiksasyon için her oyuğa 200 μL% 10 formalin ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Formalini aspire edin ve her kuyuyu 3 kez deiyonize su ile yıkayın.
3. Geçirgenlik için her bir oyuğa PBS'de 200 μL% 0.2 Triton X-100 ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Triton X-100'ü aspire edin ve her kuyuyu 3 kez deiyonize su ile yıkayın.
4. Her oyuğa 200 μL TRAP leke çözeltisi ekleyin. Lekeyi mikroskop altında görselleştirin. Lekenin düzgün bir şekilde gelişmesi 10-30 dakika sürecektir.
5. Lekeyi aspire edin ve her bir kuyuyu 3 kez deiyonize su ile yıkayın ve havayla kurutun. Daha fazla gözlem yapmak için oda sıcaklığında tutun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-c-Fms antikoru			AFS98, bir sıçan monoklonal, antimurin, c-Fms antikoru (IgG2a)
SIRA	PEPROTECH TEKNOLOJISI	315-11	Rekombinant Murin sRANK Ligandı, Kaynak: E.coli
M-CSF (Mali İşler Örgütü)			Rekombinant insan M-CSF. 10 cm'lik bir süspansiyon kültür kabında 5X106 hücrelerde 1/10 hacim CMG14–12 hücre hattı kültürü süpernatanı.
α-MEM	Wako (Vahşi)		L-Glutamin ve fenol kırmızısı ile
Fetal Sığır Serumu	Biyobatı	S1820-500	Fetal Sığır Serumu Fransız Kökenli
Kültür tabağı	Corning		100 mm x 20 mm tarzı çanak
96 oyuklu plaka	Thermofisher Bilimsel		Nun clon Delta yüzeyi

Serisi