>1. Drosophila'da Viral Enfeksiyon
- Nano enjeksiyon ile sinekleri enfekte edin ve hayatta kalma testleri yapın.
- Enjeksiyon iğnelerini hazırlamak için kılcal damarları çekin, enjeksiyon iğnesini yağla geri doldurun ve enjektörü monte edin.
- Anestezi, hafif bir CO2 akışı altında ped üzerinde uçar. Sinekleri 50.6 nL virüs çözeltisinin (100 PFU, Tris-HCl tamponu ile seyreltilmiş, pH 7.2) göğüs içi enjeksiyonu ile aşılayın. En az 3 şişe sinek enjekte edin (şişe başına 20 sinek).
not: Enjeksiyon zaman alıcıdır (genellikle saatte 100 sinek) ve Drosophila C virüsü (DCV) replikasyonu çok hızlıdır, bu nedenle her bir şişeyi (20 sinek) bitirdikten sonra tüpe tam zamanı yazmak çok önemlidir. Yalnızca arabellek enjeksiyonu, sahte bir kontrol olarak ayarlanır. Genellikle, erkek yetişkin sinekler tercih edilir, çünkü çiftleşme ve üreme sırasındaki hormonal değişiklikler dişilerin okumasını etkileyebileceğinden, sonuçlar dişiler kullanıldığında olduğundan daha stabil ve tekrarlanabilirdir.
- Enjekte edilen sinekleri normal bir aydınlık / karanlık döngüsü altında 25 ° C'de,% 60 nemde büyütün. Sinekleri günlük olarak taze yiyeceklerle besleyin ve ölü sineklerin sayısını kaydedin.
- En az 3 biyolojik kopya gerçekleştirin ve hayatta kalma eğrisini çizin.
- Sağkalım verilerinin istatistiksel analizi için, istatistiksel yazılım ile Kaplan-Meier sağkalım eğrileri oluşturun. P değerlerini hesaplamak için bir günlük sıralama testi yapın. Hayatta kalma tablosunda, her konu için bilgi girin. Yazılım daha sonra her seferinde hayatta kalma yüzdesini hesaplar ve bir Kaplan-Meier hayatta kalma grafiği çizer.
not: Şişeye ilave maya EKLEMEYİN. Sahte kontrollerle karşılaştırıldığında, DCV ile enfekte olmuş sinekler bazen asitlidir ve beceriksizdir, bu da onları yapışkan mayaya karşı savunmasız hale getirir. Enfekte sinekler için büyük ölümün gerçekleşeceği bir zaman dilimi bulmak için ön deneyde daha fazla zaman noktası kaydetmek daha iyidir. Genel olarak, enfekte sinekler, Dicer-2 mutant hatları için bile ilk iki gün içinde nadiren ölürler. 100 PFU DCV ile enfekte olmuş Wolbachia içermeyen w1118 (Bloomington 5905) sineği için bu süre enfeksiyondan yaklaşık 3-5 gün sonradır. Enjeksiyondan sonraki 0,5 saat içinde ölen meyve sinekleri, viral enfeksiyon nedeniyle değil, iğne yaralanması ile öldürülebilecekleri için ölüm olarak sayılmamalıdır.
2. Sitopatik etki (CPE) testi ile DCV yük ölçümü
- 1. günde, 1.1.1-1.1.2 adımlarında anlatıldığı gibi erkek sinekleri enfekte edin. Enjekte edilen sinekleri 20'li gruplar halinde gruplandırın ve istenen süre boyunca (tipik olarak 24 saat veya 3 gün) taze sinek yemi üzerinde büyümelerini sağlayın. Sineklere günlük taze yiyecek sağlayın.
- 2. günde, Drosophila S2* hücrelerini 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında yaklaşık 5 x106 ila 1x107 hücre / mL yoğunluğa kadar tohumlayın.
- 3. günde, 5 sinek toplayın (hafif bir CO2 akışı altında) ve bunları bir homojenizatör kullanarak 200 μL Tris tamponu ve seramik boncuklar ile 30 saniye boyunca 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde öğütün. Numuneleri -80 °C'de saklayın veya hemen bir sonraki adıma geçin.
- Numuneyi iyice girdaplayın. Süpernatanı yeni bir 1,5 mL tüpe filtrelemek için 1 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm'lik bir filtre kullanın.
- Süpernatantın S2 * hücreleri için tam ortam ile seri 10 kat seyreltmelerini gerçekleştirin. Kuyuya 50 μL seyreltme ekleyin. Negatif kontrol kuyusu olarak sınıflandırılan kuyuya virüssüz 50 μL kültür ortamı ekleyin.
not: Her seyreltme oranı için 8 kuyu kullanılmıştır. Tipik DCV verimi 108-10 9 PFU/mL civarında olduğundan, seyreltme en az ~10-5-10-10'u kapsamalıdır.
- 4. günde, CPE'yi 20X veya 40X objektifli bir parlak alan mikroskobu ile gözlemleyin. Hücrelerin bulanık göründüğü ve ortamın parçalarla dolu olduğu bir kuyuyu "pozitif kuyu" olarak ve hücre morfolojisinin normal olduğu bir kuyuyu "negatif kuyu" olarak sınıflandırın.
- CPE pozitif veya negatif kuyucukları sırasıyla + veya – ile işaretleyin. Ortalama virüs doku kültürü enfektif dozunu (TCID50) hesaplayın.
3. qRT-PCR ile ölçülen DCV yükü
- 1. günde, enfekte sinekler yukarıda tarif edildiği gibi uçar. Enjekte edilen erkek sinekleri (20 sinek/grup) gruplandırın ve istenen sürede, tipik olarak 24 saat veya 3 gün boyunca taze sinek yemi üzerinde büyütün. Sineklere günlük taze yiyecek sağlayın.
- 3. günde, 200 μL lizis tamponu ve 20 seramik boncuk (çap = 0,5 mm) içeren 1,5 mL'lik bir tüpte hafif bir CO2 akışı altında 5 sinek toplayın ve numuneleri 30 saniye boyunca yüksek hızda homojenizatör ile öğütün. Her tüpe 800 μL ek lizis tamponu ekleyin ve numuneleri -80 °C'de saklayın veya hemen RNA ekstraksiyonu ve qRT-PCR gerçekleştirin.
- RNaz içermeyen uçlar, tüpler ve deiyonize edilmiş, dietilpirokarbonat (DEPC) ile muamele edilmiş ve 0,22 μm membran filtreli su hazırlayın. Numuneye 200 μL kloroform (%≥99,5) ekleyin ve elle 15 saniye kuvvetlice çalkalayın. Su fazı ve organik faz net bir şekilde ayrılana kadar oda sıcaklığında 5 dakika veya daha uzun süre inkübe edin.
not: Kloroform son derece tehlikelidir ve dikkatli kullanılmalıdır. DNA kontaminasyonu riskini artıracak şekilde numuneyi girdap haline getirmeyin.
- Numuneleri 13.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- 400 μL süpernatan toplayın ve süpernatanı yeni tüplere aktarın. Aynı hacimde izopropanol (≥ %99,5) ile karıştırın, numuneleri elle 20 kez nazikçe ters çevirin ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika veya daha uzun süre çökeltin.
not: -20 °C'de yağış RNA verimini artıracaktır.
- Numuneleri 13.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Tüpün dibinde beyaz RNA peletleri görülebilir.
- Süpernatanı atın ve 1 mL %70 etanol (DEPC suyunda etanol) ekleyin ve RNA'yı yıkamak için birkaç kez ters çevirin.
- Numuneleri 13.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatan ve kuru RNA'yı 5-10 dakika atın; RNA şeffaf hale gelmelidir.
- Numuneye 50 μL DEPC suyu ekleyin, birkaç kez pipetleyin ve girdap yapın.
- RNA konsantrasyonunu titre etmek için 3 μL RNA alın. RNA'yı 260 nm'de ölçün. Normalde, bu protokol ile ekstrakte edilen RNA konsantrasyonu, cDNA sentezi için uygun olan yaklaşık 100-500 μg/μL'dir.
- cDNA sentezi için 2 μg RNA kullanın. Numuneyi ddH2O ile 100 μL'ye seyreltin ve -20 °C'de saklayın.
- qRT-PCR'yi üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin ve qRT-PCR.
çalıştırın
not: DCV'nin cDNA sentezi için, rastgele primerler Poly A primerlerinden çok daha iyi çalıştı. DCV mRNA ekspresyonu, endojen ribozomal protein 49 (rp49) mRNA'ya normalize edilir. Bu bölümde kullanılan oligonükleotid primerleri:
rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (ileri) ve
5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (ters);
DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (ileri) ve
5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (ters);
vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (ileri) ve
5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (ters);
virüs kaynaklı RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (ileri) ve
5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (ters).