Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Farelerin ve DSS'nin Hazırlanması
- Nakavt (α-gustducin-/-) fareleri ve yaş, cinsiyet ve vücut ağırlığı uyumlu vahşi tip kontrol (α-gustducin+/+) C57BL/6 fareleri ayrı ayrı temiz kafeslerde saklayın.
not: Nakavt fareler, 20 nesilden fazla bir süredir C57BL / 6 fareleri ile geri çaprazlanmıştır ve yaklaşık% 100 C57BL / 6 genetik geçmişine sahiptir.
- 30 g dekstran sülfat sodyum (DSS) tozunu 1 L otoklavlanmış suda çözün. Nihai çalışma konsantrasyonunun %3 (a/h) olduğundan emin olmak için çözelti berraklaşana kadar karıştırın.
not: DSS solüsyonu oda sıcaklığında 1 haftaya kadar veya kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir.
>2. Farelerde DSS Kolitinin İndüksiyonu ve Değerlendirilmesi
- Her farenin başlangıçtaki vücut ağırlığını tartın ve kaydedin. Fareleri ayrı ayrı standart plastik kafeslere yerleştirin ve kafesleri etiketleyin.
- Normal içme suyunu, her iki fare grubunun da ad libitum'a erişebildiği toplam 7 gün boyunca% 3 DSS çözeltisi ile değiştirin.
- Farenin vücut ağırlığını ölçün, DSS solüsyonu tüketimini kaydedin ve DSS uygulaması sırasında her farenin dışkısını günlük olarak toplayın ve inceleyin. İshal ve rektal kanamanın şiddetini gözlemleyin ve bunu DSS'nin neden olduğu hastalık indeksine dönüştürün.
- Deney sırasında, kolit semptomlarını değerlendirmek için başlangıç ağırlığına kıyasla kilo kaybı yüzdesi ve hastalık indeksi hesaplanır.
not: Hastalık indeksi, ishal ve rektal kanama gözlemlerinin birleştirilmesiyle puanlanır ve şu şekilde tanımlanır: 0 (normal dışkı, kan yok), 1 (yumuşak dışkı, kan yok), 2 (yumuşak dışkı, az kan), 3 (çok yumuşak dışkı, hafif kanama) ve 4 (sulu dışkı, belirgin kanama). Hastalık indeksi her fare için günlük olarak analiz edilir.
- 7 günlük DSS tedavisinin sonunda, fareleri servikal çıkık ile feda edin ve kalan deneylere devam edin.
3. Doku Örneklerinin Hazırlanması
- Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve karın derisini% 70 etanol ile temizleyin. Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için küçük bir makasla karın bölgesinde 3 cm uzunluğunda orta hat kesisi yapın.
- Dalağı diğer dokulardan dikkatlice ayırmak için bir çift forseps kullanın, ardından dalağı çıkarın ve boyutunu ölçün.
- Kolonu forseps ile tanımlayın ve kaldırın ve çevredeki mezenterden ayırın. Çekum ve rektum görünene kadar tüm kolonu dışarı çekin.
- Sırasıyla proksimal ve distal kolonu serbest bırakmak için kolonu kolonoçekal kenarda ve pelvisin derinliklerinde keserek izole edin. Ardından, izole edilmiş kolonun uzunluğunu ölçün ve kaydedin. Diseksiyon işlemi sırasında kolon dokusuna zarar vermemeye dikkat edin.
- Kolonu 10 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile 10 mL'lik bir şırınga ile yıkayın ve elüat tamamen berraklaşana kadar dışkıyı ve kanı çıkarmak için bir gavaj iğnesi ile donatın.
- Histolojik tanımlama için, doku örneklerini eşit olarak üç kısma bölün: proksimal, orta ve distal. Ardından, dokuyu gece boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
4. DSS'ye Bağlı Kolitin Şiddetinin Histolojik Değerlendirmesi
- Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama
- Fiksasyondan sonra, numuneleri kriyoproteksiyonla korumak için dokuyu gece boyunca 15 mL'lik bir tüpte 1x PBS'de% 30 sükroz çözeltisine batırın.
- Dokuyu optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün ve OCT sertleşene kadar -20 °C'ye yerleştirin.
- Dokuyu içeren OCT bloğunu bir kriyostata aktarın, kriyostattaki kalınlık kadranını 12 μm'ye ayarlayın ve 12 μm kalınlığındaki donmuş bölümleri dilimleyin ve toplayın.
- Toplanan doku kesitlerini bir kriyostattan 65 °C'de 20 dakika sıcak bir plaka üzerinde ısıtın.
- Bölümleri kısa bir süre damıtılmış suda yıkayın. Bunları 5 dakika hematoksilen boyama solüsyonu ile boyayın ve ardından 5 dakika akan musluk suyu ile durulayın.
- Bölümleri 30 saniye boyunca %0,5 hidroklorik asit-etanol ile ayırt edin ve akan musluk suyunda 1 dakika durulayın. Ardından, yıkamayı 1x PBS'de 1 dakika boyunca gerçekleştirin ve ardından 5 dakika boyunca akan musluk suyu ile durulayın.
- Doku bölümlerini %70, %75, %80 ve %95 alkolde her biri 10 saniye boyunca yıkayın. Eozin boyama solüsyonunda 2 dakika boyunca karşı leke yapın.
- Her seferinde 5 dakika boyunca% 95 alkol ve 2 mutlak alkol değişikliği ile dehidrasyon gerçekleştirin. 5 dakika boyunca 2 ksilen değişiminde temizleyin.
- Yukarıdaki H & E boyamanın sonuçlarına dayanarak hem gen nakavt hem de vahşi tip gruplar için her farenin proksimal, orta ve distal kolonunun doku hasarını puanlayın.
not: Hastalık indeksi, mukoza, submukoza, muskularis ve seroza bölgelerindeki epitel hasarı ve inflamasyonun birleşik bir skorudur ve şu şekilde tanımlanır: 0 (doku hasarı ve inflamasyon yok), 1 (fokal doku hasarı ve inflamasyon), 2 (yamalı doku hasarı ve inflamasyon) ve 3 (yaygın doku hasarı ve inflamasyonu). Kolonun proksimal, orta ve distal kısımları için fare başına üç puan daha sonra her hayvan için toplam bir puan elde etmek üzere toplanır. Daha sonra her grup için ortalama puanlar hesaplanır.
