$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İnsan monositlerinin izolasyonu ve makrofajlara farklılaşması
- Bölgesel bir kan bankasında tanımlanmamış sağlıklı bireylerden antikoagüle kan alın ve periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) aşağıda belirtildiği gibi izole edin.
not: Tüm adımları bir doku kültürü laminer akış başlığında gerçekleştirin. Sadece steril tüpler kullanın ve eldiven giyin. Atarken kanla ilgili tüm ürünlere% 10 çamaşır suyu ekleyin. Steril fosfat tamponlu salin (PBS) (1x) veya Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) (Ca2+ ve Mg2 + olmadan) birbirinin yerine kullanılabilir.
- Seyreltme tamponunu hazırlayın: 1x steril PBS'yi %2 fetal sığır serumu (FBS) ve 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile destekleyin.
- Kültür ortamını hazırlayın: RPMI-1640 ortamını FBS (% 10 (h / h)), glutamax (2 mM) ve Penisilin / Streptomisin (50 IU / 50 μg / mL) ile destekleyin
- Çalışan arabelleği (Malzeme Tablosu) üreticinin protokolüne göre önceden soğutun.
- Tam kanı iki hacim seyreltme tamponu ile seyreltin. Serolojik bir pipet kullanarak, antikoagüle edilmiş kanın 15 mL'sini 30 mL seyreltme tamponu içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- Her 10 mL tam kan veya 30 mL seyreltilmiş kan için, 50 mL boş bir tüpe 15 mL yoğunluk gradyan ortamı ekleyin.
- Yoğunluk gradyan ortamını adım 1.1.5'ten itibaren 30 mL seyreltilmiş kan ile 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak yavaş ve sabit bir şekilde katmanlayın. Pipetin ucunu tüpün duvarına ve tüpü eğik bir açıyla tutun.
- Tüpleri dikkatlice sallanan bir kova santrifüjüne aktarın. İki aşamayı rahatsız etmekten kaçının. Tüpleri 400 x g'da oda sıcaklığında (RT) 25 dakika boyunca hızlanma ve yavaşlama minimum değere ayarlanmış olarak santrifüjleyin.
- 10 mL'lik bir pipet kullanarak üst (şeffaf) plazma tabakasını dikkatlice çıkarın ve ağartıcı (% 10) içeren bir kaba atın.
- Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler, Şekil 1) interfaz (beyaz) tabakasını 10 mL'lik bir pipetle toplayın ve 50 mL'lik taze bir tüpe aktarın. Aynı donörün farklı tüplerinden alınan beyaz tabakayı 30 mL'ye kadar 50 mL'lik bir tüpte birleştirin.
- Adım 1.1.1'deki seyreltme tamponu ile her tüpü toplam 50 mL hacme getirin ve 300 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 10 mL'lik bir pipetle çıkarın ve ağartıcı içeren bir kaba (% 10) atın.
- Her hücre peletini bir p1000 mikropipet kullanarak adım 1.1.3'ten itibaren önceden soğutulmuş çalışma tamponunun 1 mL'sinde yeniden süspanse edin. Aynı donörden alınan hücre süspansiyonlarını 15 mL'lik yeni bir tüpte birleştirin. Önceden soğutulmuş çalışma tamponu ile her tüpün hacmini 15 mL'ye getirin ve ters çevirerek iyice karıştırın.
- Adım 1.1.11'den 20 μL'lik bir hücre süspansiyonu alikotu alın ve 1x steril PBS kullanarak 1:100 seyreltme hazırlayın. Bir hemositometre kullanarak hücre numarasını belirleyin.
- Hücre süspansiyonunu adım 1.1.11'den itibaren 300 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı 10 mL'lik bir pipetle çıkarın. Gerekirse, süpernatanı tamamen çıkarmak için bir p200 mikropipet kullanın.
- İzole edilmiş PBMC'leri, her 1 x 107 hücre için 80 μL önceden soğutulmuş MACS çalışma arabelleğinde yeniden askıya alın ve maksimum 800 μL'ye kadar tampon ekleyin.
- Her 1 x 107 hücre başına 20 μL anti-insan CD14 Mikro Boncuk veya kan örneği başına 100 μL'ye kadar (~ 100 mL seyreltilmemiş kan) ekleyin. Ters çevirerek iyice karıştırın ve 4 ° C'de sürekli karıştırma ile 20 dakika boyunca bir tüp döndürücü üzerine yerleştirin.
- Numuneleri tüp döndürücüden çıkarın, her tüpe 10 mL önceden soğutulmuş çalışma tamponu ekleyin ve 300 x g'da (hızlanma = 5, yavaşlama = 5) ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı 10 mL'lik bir pipetle çıkarın ve 500 μL önceden soğutulmuş çalışma tamponunda (2 x 108/mL) 1 x 108 hücreye kadar yeniden süspanse edin.
- CD14 pozitif hücrelerin izolasyonunu, üreticinin talimatlarına göre manuel veya otomatik bir sistem (Malzeme Tablosu) kullanarak manyetik hücre sıralama ile gerçekleştirin.
- CD14 pozitif seçiminden sonra adım 1.1.18'den 20 μL'lik bir hücre süspansiyonu alikotu alın ve 1x steril PBS kullanarak 1:100 seyreltme hazırlayın. Bir hemositometre üzerindeki hücreleri sayarak hücre sayısını belirleyin.
- CD14 pozitif hücreleri 300 x g'da santrifüjleyin ve 10 dakika boyunca RT'yi çıkarın. 10 mL'lik bir pipet veya vakum sistemi kullanarak süpernatanı çıkarın.
- Hücre peletini önceden ısıtılmış bir kültür ortamında adım 1.1.2'den adım 1.1.2'den 1 x 107 hücre / mL'lik bir nihai hücre yoğunluğuna yeniden süspanse edin.
- İzole edilmiş CD14 pozitif monositleri 5 x 106 hücreli bir hücre yoğunluğunda tohumlayın.
- 10 cm'lik bir doku kültürü kabına, 50 ng / mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile desteklenmiş adım 1.1.2'den 10 mL kültür ortamı ekleyin.
- 1.1.21 adımından kültür ortamına damla damla 0.5 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve plakayı hafifçe döndürün. Hücreleri gece boyunca nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO2) inkübe edin.
- Ertesi gün, gece boyunca bağlanmayan hücreleri çıkarmak için bir vakum sistemi kullanarak ortamı aspire edin. 10 mL taze kültür ortamı takviyeli GM-CSF (50 ng/mL) ekleyin ve tam farklılaşmaya izin vermek için hücreleri nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2) 7 gün boyunca inkübe edin (bkz. Şekil 2A GM-CSF'de farklılaşmanın çeşitli aşamalarında CD14 + monositlerinin görünümü için). Kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirin ve her seferinde taze GM-CSF (50 ng / mL) ile destekleyin.
2. Elektroporasyon bileşenlerinin hazırlanması
>NOT: Bu protokol 10 μL-Neon uç için tasarlanmıştır (Malzeme Tablosu). Her transfeksiyon için 1-2 x 105 hücre kullanın. Transfekte edilmiş hücrelerin 48 oyuklu bir plaka veya 8 oyuklu odacıklı bir tabak (oyuk başına 10 μL transfekte edilmiş hücre) üzerine tohumlanması önerilir. PBS yerine 1x steril DPBS (Ca2+ ve Mg2+ olmadan) kullanılabilir.
- 7. günde, RPMI-1640 ortamını FBS (% 10 (h / h)) ve glutamax (2 mM) ile destekleyerek antibiyotik içermeyen bir ortam hazırlayın.
- Serumsuz RPMI-1640 ortamı, tripsin-EDTA (% 0.25) çözeltisi, 1x steril PBS (Ca2 + ve Mg2 + olmadan) ve 1.1.2 adımından itibaren tam kültür ortamını 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Cam tabanlı tabaklar kullanıyorsanız (konfokal mikroskopi için), bulaşıkları poli-D-lizin hidrobromür ile kaplayın.
- 8 iyi odacıklı bir tabağı 200 μL poli-D-lizin hidrobromür (1x steril PBS'de 0.1 mg / mL) ile kaplayın ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
- Poli-D-lizin çözeltisini aspire edin ve camı 1x steril PBS ile bir kez yıkayın. PBS'yi aspire edin ve adım 2.4 ile devam edin.
- 48 oyuklu plakanın veya 8 iyi odacıklı tabağın oyuğu başına 200 μL antibiyotik içermeyen ortam ekleyin ve transfekte edilmiş hücreleri plakalamaya hazır olana kadar nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2) ön inkübe edin.
3. Elektroporasyon için hücrelerin hazırlanması
NOT: 7 günlük farklılaşma süresi sonunda 10 cm'lik bir tabaktan MDM verimi yaklaşık 1,5 x 106 hücredir. PBS yerine 1x steril DPBS (Ca2+ ve Mg2+ olmadan) kullanılabilir. Bu protokol, çoğu makrofajın hücre canlılığı ve bütünlüğünün korunması ile plakadan ayrılması için optimize edilmiştir. MDM'nin hücre kültürü plakalarından ayrılması zordur. Bu nedenle, hücreleri ayırmak için 3.2 ve 3.3 adımlarını iki kez gerçekleştirmek gerekebilir. Tripsin-EDTA (% 0.25) ile her inkübasyon süresinin 5 dakikayı geçmediğinden emin olun.
- 10 cm'lik tabaklar üzerinde tamamen farklılaşmış makrofajlardan ortamı aspire edin ve hücre tek tabakasını ılık serumsuz RPMI-1640 ortamı ile yıkayın. Ortamı tamamen çıkardığınızdan emin olun.
- 10 cm'lik tabak başına 2 mL ılık tripsin-EDTA (% 0.25) çözeltisi ekleyerek hücreleri hasat edin ve nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2) 5 dakika inkübe edin.
- Tripsin-EDTA (%0.25) solüsyonunu bir p1000 mikropipet kullanarak tüm tabak alanı boyunca yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyerek hücre ayrılmasını tamamlayın. Hücre süspansiyonunu, adım 1.1.2'den itibaren 5 mL sıcak tam kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Çanağı parlak bir alan mikroskobuna götürün ve çeşitli görüş alanlarında hücre dekolmanı olup olmadığını kontrol edin. Hala bağlı olan önemli miktarda hücre varsa, 3.2-3.3 adımlarını tekrarlayın.
- Hücre süspansiyonunu RT'de 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin.
- Ortamı aspire edin ve hücreleri önceden 37 ° C'ye ısıtılmış 10 mL 1x steril PBS'de yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını belirlemek için 20 μL'lik bir alikot alın.
- Amaçlanan transfeksiyon başına 1-2 x 105 hücre alın ve 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Önceden ısıtılmış 1x steril PBS ile 15 mL'lik son hacme getirin. RT'de 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin.
- PBS'yi aspire edin ve 250 x g'da 1 dakika boyunca bir kez daha santrifüjleyin. Bir p200 mikropipet kullanarak hücre peletinden kalan PBS'yi çıkarın.
4. Kaspaz BiFC bileşenlerinin insan monositinden türetilmiş makrofajlara çekirdeklenmesi
>NOT: Protokolün bu bölümü Neon Transfeksiyon Sistemi (Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol, 10 μL Neon uç kullanarak 1-2 x10 5 hücreyi transfekte etme adımlarını ana hatlarıyla belirtir (Malzeme Tablosu). 100 μL Neon uç kullanıyorsanız, ölçeği buna göre büyütün. Hücreleri 15 dakikadan daha uzun süre yeniden süspansiyon tamponu R'ye maruz bırakmaktan kaçının, çünkü bu hücre canlılığını ve transfeksiyon verimliliğini azaltabilir.
- Raportör plazmidini (yani, mCherry veya dsRedmito'yu 100 ng / μL'de) transfekte edilmiş hücreleri görselleştirmek için nükleaz içermeyen su veya 0.5x TE tamponu içinde seyreltin.
- Kaspaz BiFC plazmitlerini nükleaz içermeyen su veya 0.5x TE tamponu içinde uygun bir konsantrasyona seyreltin, böylece toplam plazmit hacmi 10 μL'lik toplam transfeksiyon hacminin% 30'unu geçmez (ör., 300 ng / μL C1 Pro-VC ve 300 ng / μL C1 Pro-VN).
- Amaçlanan transfeksiyon başına 1.5 mL'lik steril bir mikrotüp hazırlayın ve uygun miktarda raportör plazmid (ör., 50 ng veya 0.5 μL) ve kaspaz BiFC plazmitleri (ör., 300 ng veya 1 μL C1 Pro-VC ve 300 ng veya 1 μL C1 Pro-VN fragmanı). Mikrotüpleri her zaman davlumbazın içinde tutun.
- Pipet istasyonunu, cihazı, uçları, elektroporasyon tüplerini ve pipeti steril bir laminer akış başlığına yerleştirin.
not: Pipet istasyonu, cihaz, uçlar, elektroporasyon tüpleri ve pipet Neon Transfeksiyon Sistemine dahildir.
- Pipet istasyonundaki yüksek voltaj ve sensör konektörünü üreticinin talimatlarına göre cihazın arka bağlantı noktalarına bağlayın. Pipet istasyonunu cihaza yakın tutun.
- Güç kablosunu arka AC girişine bağlayın ve cihazı elektrik prizine bağlamaya devam edin. Cihazı açmak için güç düğmesine basın.
- Cihaz açıldığında ve uygun şekilde bağlandığında görüntülenen başlangıç ekranına transfeksiyon parametrelerini girin. Voltaj'a basın, 1000 girin ve voltajı 1000 V'a ayarlamak için Done'ye basın. Genişlik'e basın, 40 girin ve darbe süresini 40 ms'ye ayarlamak için Bitti'ye basın. Son olarak, # Darbeler'e basın, 2 girin ve elektrik darbelerinin sayısını 2'ye ayarlamak için Bitti'ye basın.
- Elektroporasyon tüplerinden birini (kitte verilir) alın ve RT'de 3 mL elektrolitik tampon E (10 μL uçlar için ve kitte bulunur) ile doldurun. Elektroporasyon tüpünü pipet istasyonundaki pipet tutucusuna yerleştirin. Tüpün yan tarafındaki elektrotun içe baktığından ve tüp yerleştirildiğinde bir klik sesi duyulduğundan emin olun.
- Adım 3.8'den hücre peletini alın ve her 1-2 x 105 hücre için 10 μL önceden ısıtılmış resüspansiyon R tamponu (kitte verilir) ekleyin. Bir p20 mikropipet ile nazikçe karıştırın. Adım 4.3'te ayarlanan her tüpe 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve bir p20 mikropipet ile hafifçe karıştırın.
- Pipeti alın ve ikinci duraktaki Basma düğmesine basarak bir uç yerleştirin. Kelepçenin uçtaki pistonun montaj milini tamamen aldığından ve pipetin üst kafasında herhangi bir boşluk gözlenmediğinden emin olun.
- Numuneyi aspire etmek için, pipet üzerindeki Push düğmesine ilk sonuna kadar basın ve hücre/plazmit DNA karışımını içeren ilk tüpe daldırın. Karışımı yavaşça pipet ucuna aspire edin.
not: Elektroporasyon sırasında ark oluşumuna neden olabileceğinden ve cihaz tarafından algılanırsa elektrik darbesinin iletilmesini engelleyebileceğinden hava kabarcıklarından kaçının. Hava kabarcıkları gözlenirse, içindekileri tüpe bırakın ve tekrar aspire etmeyi deneyin.
- Numunenin bulunduğu pipeti çok dikkatli bir şekilde pipet tutucusuna yerleştirin. Pipetin tık sesi geldiğinden ve doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
- Dokunmatik ekranda Başlat düğmesine basın ve elektrik darbeleri verilene kadar bekleyin. Ekranda bir mesaj tamamlandığını gösterecektir.
- Pipeti istasyondan yavaşça çıkarın ve transfekte edilmiş hücre süspansiyonunu, ilk durdurma düğmesine yavaşça basarak 2.4. adımdan itibaren önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen besiyeri olan ilgili kuyucuğa hemen ekleyin.
not: Bu uç, aynı plazmit için üç defaya kadar yeniden kullanılabilir; aksi takdirde, ikinci durağa kadar Push düğmesine basarak biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına atın.
- Bir hücre/plazmit DNA karışımı içeren her tüp için 4.10-4.14 adımlarını tekrarlayın.
- Plakayı transfekte edilmiş hücrelerle nazikçe sallayın ve nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2) 1-3 saat inkübe edin.
- Her bir oyuğa adım 1.1.2'den itibaren 200 μL önceden ısıtılmış kültür ortamı (tam ortam) ekleyin. Çanağı tekrar nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörüne (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin. Gen ifadesi için en az 24 saat bekleyin.
- Ertesi gün, bir epifloresan mikroskobu kullanarak hücre canlılığını ve transfeksiyon verimliliğini inceleyin.
- Epifloresan mikroskobunu ve floresan ışık kaynağı kutusunu üreticinin talimatlarına göre açın ve kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin.
- 10x veya 20x hedefi ve 568 nm (RFP) filtresini seçin.
- Hücre canlılığını tahmin etmek için, seçilen alandaki tüm hücreleri görselleştirmek için İletilen Işık LED'i (TL) düğmesine basın. Mikroskop merceğine bakarken, hücreler görülene kadar odak düğmesini çevirin ve seçilen alanda hücre eki olup olmadığını kontrol edin.
not: Tam olarak bağlı hücreler canlı hücreleri temsil ederken, yüzen hücreler canlı olmayan hücreleri temsil eder. Kuyu birleşmesi yüksekse, bağlı olmayan hücrelerin varlığı, düşük canlılığın sonucu değil, hücre sayısının fazla tahmin edilmesinin bir sonucu olabilir. Bununla birlikte, yüksek bir yüzen hücre içeriğinin eşlik ettiği düşük birleşme, elektroporasyon sırasında ark, plazmit toksisitesi veya yeniden süspansiyon R tamponuna aşırı maruz kalmadan kaynaklanabilecek düşük canlılığı ifade eder. İkinci davranışı gösteren kuyuları kullanmayın.
- Transfeksiyon verimliliğini tahmin etmek için, yukarıda açıklandığı gibi iletilen ışık altında seçilen alandaki hücrelere odaklanın. Seçili alandaki toplam hücre sayısını sayın. İletilen Işık LED'i (TL) kapalıyken, açmak için Yansıyan Işık LED düğmesine (RL) basın.
- Raportör gen floresansına (kırmızı hücreler) ince odaklanın ve toplam kırmızı floresan hücre sayısını sayın. Kuyu başına en az iki alan daha için bu adımları (4.18.4-4.18.5) tekrarlayın.
5. Transfekte MDM ve kaspaz BiFC veri toplama tedavisi
>NOT: Hücreleri bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak görüntülemeyi planlıyorsanız, kaspaza bağımlı hücre ölümünü önlemek için seçilen uyaranla tedaviden önce 1 saat boyunca qVD-OPh (20 μM) ile tedavi edilmesi önerilir (ağırlıklı olarak apoptoz). Bu, hücrelerin apoptoz nedeniyle kalkmasını önlemek için görüntülemede kullanılır, bu da odak düzleminden çıktıklarında görüntülenmelerini çok zorlaştırır. Aktivasyon platformuna kaspaz alımının ve ilişkili kaspaz BiFC'nin, kaspazın katalitik aktivitesine bağlı olmadığını ve sonuç olarak kaspaz inhibisyonunun bu adımı etkilemeyeceğini unutmayın.
- Transfeksiyondan yaklaşık 24 saat sonra seçilen uyaranla tedavi edin ve her ilaç için gerektiği kadar inkübe edin.
- 1.1.2. adımdan itibaren kültür ortamını Hepes (20 mM, pH 7.2-7.5) ve 2-merkaptoetanol (55 μM) ile destekleyerek görüntüleme ortamını hazırlayın.
- İstenilen uyaran konsantrasyonunu önceden ısıtılmış görüntüleme ortamına ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- Ortamı bir p1000 mikropipet ile hücrelerden dikkatlice çıkarın ve kuyu kenarına adım 5.1.2'den itibaren 500 μL uyarıcı solüsyon ekleyin.
- İşlenmemiş kontrol kuyularını çalıştırmak için, uyaran olmadan bir görüntüleme ortamı ekleyin.
- Hücreleri nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO2) her tedavi için belirtildiği kadar uzun süre inkübe edin.
- Hücreleri bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak görselleştirin.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek mikroskobu ve flüoresan ışık kaynağını açın.
- 10x veya 20x objektifi seçin ve kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin.
- Mikroskop merceğini kullanarak, 568 nm filtrenin altındaki hücreleri bulun ve dsRedmito/mCherry raportörünü (kırmızı hücreler) ifade eden hücrelere odaklanın.
- Görme alanındaki tüm kırmızı hücreleri sayın ve sayıyı kaydedin.
- Aynı görsel alandayken, 488 veya 512 filtrelerine (GFP veya YFP) geçin, aynı zamanda yeşil olan kırmızı hücrelerin sayısını saymaya devam edin (Venüs pozitif veya BiFC pozitif) ve sayıyı kaydedin.
- En az üç ayrı görsel alandan en az 100 dsRedmito/mCherry pozitif hücre sayın.
