Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Deney hazırlığı
- Bağırsak organ kültürü cihazının imalatı (3 gün)
- Bir 3D yazıcı kullanarak, organ kültürü cihazı için yeniden kullanılabilir plastik kalıpları yazdırın (cihazın 24 küçük ve büyük delikli 6 kuyusu ve cihaz kapak kapağı için vardır).
NOT: Bu plastik kalıplar çok sayıda cihazın imalatı için kullanılabilir.
- Kör uçlu iğneleri (22 G ve 18 G) cihaz kalıbı içindeki uygun konuma yerleştirin ve bir set cihaz ve kapak için yaklaşık 20 g polidimetilsiloksan (PDMS) karışımı (1:10 ağırlık oranı, tabana katalizör) dökün.
- PDMS karışımındaki hava kabarcıklarını gidermek için kalıpları 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin.
- PDMS polimerizasyonunu tamamlamak için kalıpları gece boyunca 55 °C'de inkübe edin.
- PDMS ayarlandığında, iğneleri kalıptan dışarı çekin ve kültür cihazını ve kapağı plastik kalıplardan dikkatlice serbest bırakın.
- Cerrahi bir bıçak kullanarak PDMS kalıntılarını kuyu taslağından çıkarın. PDMS cihazını ve cihaz kapağını toksik olmayan silikon yapıştırıcı kullanarak bir kapak camına (75 mm x 50 mm mikro slaytlar) takın ve parçaları gece boyunca sertleşmeye bırakın (yapıştırıcıyı cihazın düz tarafına uygulayın).
- Lümen için on iki adet 22 G iğne ve kuyu için on iki adet 18 G iğne yerleştirin. Tüm iğneleri silikon kullanarak yerine sabitleyin ve gece boyunca kurumasına izin verin. Bağırsak organ kültürü cihazının içine ve dışına uygun hava akışı için kapak kapağına iki adet 18 G iğne sokun.
- Su dolu bir şırınga kullanarak tüm iğnelerde sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Kuyuları su ile doldurarak kuyulardan sızıntı olmadığını kontrol edin.
- Kolona bağlanacak her 22 G iğneye iki adet cerrahi düğüm yerleştirin. Cihazı ve kapağı bir otoklav kağıt torbasına yerleştirin ve bir otoklavda sterilize edin.
- Kültür ortamı (0,5 saat)
- Biyolojik bir başlıkta, aşağıdakileri karıştırın (50 mL'lik bir tüpte): 37 mL Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (IMDM), 10 mL KSR serum replasmanı, 1 mL B27 takviyesi, 0.5 mL N2 takviyesi, 0.5 mL 1 M HEPES tamponu ve 0.5 mL esansiyel olmayan amino asitler.
- Süzün ve tüm ortamı 4 °C'de saklayın.
- Tüp ve cerrahi alet hazırlığı
- Giriş lümeni, giriş kuyusu, çıkış lümeni ve çıkış kuyusu (12 kısa tüp ve 12 uzun tüp) için uygun uzunlukta tüpleri kesin. Tüpün her iki tarafına uygun bir adaptör bağlayın.
- Cerrahi aletleri hazırlayın: düz makas, 4x ince forseps ve 2x keskin forseps.
- Tüpleri ve cerrahi aletleri bir otoklav kağıt torbaya koyun ve bir otoklav kullanarak sterilize edin.
- Luminal girişi hazırlayın (istenen stimülasyon - bakteri, dışkı, ilaçlar vb.).
- Deneyden önce, bakteri kültürünün bakteri yükünü, seri seyreltmelerle ve aerobik ve/veya anaerobik koşullar altında kültürle belirleyin.
- Bakteri yükünü hesapladıktan sonra, gerekli bakteri konsantrasyonunu elde etmek için bakteri kültürlerini steril bir doku kültürü ortamında seyreltin. Dışkı örnekleri için 100 μm'lik bir süzgeç kullanarak filtreleyin.
not: Bakteriyel olmayan stimülasyon için (ilaçlar, metabolitler, vb.), Bağırsak kültürü ortamını kullanarak maddeyi gerekli konsantrasyona seyreltin.
2. Deney düzeneği hazırlığı
- Organ kültürü inkübatörünün içinde, ısıtıcı üniteyi açın ve 37 °C'ye ayarlayın.
- Pompaların yanı sıra giriş ve çıkış şırıngalarını da ayarlayın.
- Doku kültürü ortamı girişi
- Biyolojik veya laminer bir akış başlığında, giriş kuyusu şırıngalarını tam bir kültür ortamı ile doldurun. Son hacim, deneyin süresine ve akış hızına bağlıdır; genellikle 1 mL/s artı temizleme için ek bir ortam.
- Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırıngalara bağlayın. Doldurulmuş şırıngaları şırınga pompalarına yerleştirin.
- Giriş şırıngalarını boşaltın. Kuyu ortamının tüm tüplerden atık bir cama aktığından emin olun.
- Lümen girişi
- Luminal giriş şırıngalarını stimülasyon tedavisi (bakteri, ilaçlar vb.) ile doldurun. Hacim, deneyin süresine ve akış hızına bağlıdır (genellikle 30 μL/s artı boşaltma için ek bir ortam).
- Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırıngalara bağlayın. Doldurulmuş şırıngaları şırınga pompalarına yerleştirin.
- Giriş şırıngalarını boşaltın. Stimülasyonun tüm tüplerden atık bir bardağa aktığından emin olun. Farklı stimülasyonları kirletmemeye dikkat edin.
- Çıkış
- Boş şırıngaları çıkış şırınga pompalarına yerleştirin (pompa modunu 'çekme' olarak ayarlayın).
- Cihaz kurulumu
- Gaz karışımını kontrol eden regülatörü (%95 O2 + %5 CO2) yumuşak, minimum akış için ayarlayın.
- Cihazı laminer bir başlıkta inceleyin.
- İğneleri yıkamak için cihazın iğnelerini steril IMDM ile yıkayın.
- Cihazın her bir oyuğuna 500 μL steril kültür ortamı ekleyin.
- Doku diseksiyonu için hazırlık
- Steril cerrahi aletleri laminer başlığın içine yerleştirin.
- 10 mL'lik bir şırıngayı steril IMDM ile doldurun ve kolonun yıkanması için steril (otoklavlanmış) 22 G künt uçlu bir iğne bağlayın.
3. Organ kültürleri
- Farelerin kurban edilmesi ve doku diseksiyonu
- Laminer bir başlıkta, 12 ila 14 günlük fareleri dekapitasyon ile kurban edin. Farelere% 70 etanol püskürtün ve fareleri plastik bir tabağa koyun.
- Keskin makas ve forseps kullanarak fareyi inceleyin ve tüm yağ ve bağ dokularını keserek mideden anüse kadar sindirim sistemini çıkarın. İki nokta üst üste kesin ve yeni bir tabağa koyun.
not: Kolon dokusu ile teması en aza indirin. Kolon dokusunun orta kısmına dokunmayın. Dokuyu nazikçe ve sadece dokunun kenarlarından tutun.
- Kolon yıkama ve yıkama
- Diseksiyon mikroskobu altında, hazırlanan 10 mL şırınga ile kolon içeriğini steril IMDM ile (proksimal tarafa) nazikçe yıkayın (adım 2.7.2). Dışkıyı bağırsak dokusundan çıkardıktan sonra, kolonu 0.5 mL steril IMDM ile doldurulmuş 6 oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin.
- Kolonun cihaza bağlanması
- Dokuyu alın, dikkatlice 22 G iğneye bağlayın ve iki iplikle sıkı bir bağ yapın. Bu noktada, kolonun lümen akışına doğru oryantasyonunu korumak zorunludur (proksimal = giriş, distal = çıkış). 6 dokunun tümü için 3.2-3.3 adımlarını tekrarlayın.
- Giriş iğnesi Luer kilitlerinin ortamdan boş olduğunu doğrulayın. Değilse, boşaltın. Giriş iğnesi Luer kilidine stimülasyonlar ekleyin (lümene hava kabarcıklarının girmesini önlemek için). Uygun stimülasyonla her kolon için bu adımı tekrarlayın.
- Tüm dokuların bağlı olduğunu kontrol edin ve kapak kapağını cihazın üzerine yerleştirin.
- Organ kültürü cihazının pompalara bağlanması
- Cihazı önceden ısıtılmış sıcaklık kontrollü hazneye (37 °C) yerleştirin.
- Gaz akışını bağlayın
- Uygun giriş iğnesini kullanarak gaz adaptörünü kapak kapağına bağlayın.
- Giriş ve çıkış tüplerini cihaza bağlayın.
not: Proksimal kolon tarafını giriş küvetlerine bağlayın.
- Stimülasyon girişleri ile lümeni boşaltın.
- Bağırsaktan hafifçe luminal stimülasyon akıtın ve çıkış tüplerindeki orta akışı doğrulayın.
- Dış ortamı yıkayın.
- Dış ortamı 3 kez yıkayın (pompaları hem giriş hem de çıkış kuyusu için 600 μL/dk hızına ayarlayın). Her yıkama 1 dakika sürer (kuyuyu boşaltarak başlayın).
- Denemeyi başlatın.
- Pompaları aşağıdaki hızlarda başlatın:
Akış hızı: lümen: giriş - 30 μL / s, çıkış - 35 μL / s < br / >
Dış ortam: giriş - 1000 μL / s, çıkış - 950 μL / s < br / >
not: Deney süresi 30 dakika ile 24 saat arasında değişebilir.
- Deney sonu (kolon organ kültürleri için 24 saate kadar)
- Tüm tüpleri cihazdan ayırın.
- Dokuları iğnelerden ayırın ve istenen okumalara devam edin.
