İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. WS-CM Hazırlığı
- Daha önce açıklandığı gibi tam duman şartlandırılmış ortam (WS-CM) oluşturun.
- Aşağıdaki sigara içme rejimini kullanarak fenol kırmızısı içermeyen Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamından dört adet 3R4F referans sigarasından duman geçirerek WS-CM'yi hazırlayın: 35-60-2, ml cinsinden nefes hacmi, saniye cinsinden nefes aralığı ve saniye cinsinden nefes süresi, sırasıyla. Her preparat 20 ml'lik bir numune oluşturur.
- Tüp(ler)i tarih, tamamlanma saati ve sigara adı ve numarası ile etiketleyin. Sigara içimi tamamlandıktan hemen sonra 500 μl'lik alikotları -80 °C'de saklayın.
- Daha önce tarif edildiği gibi nikotin, tütüne özgü nitrozaminler ve polisiklik aromatik hidrokarbonların seviyelerini belirlemek için donmuş WS-CM'nin alikotlarını analiz edin.
2. Periferik kan mononükleer hücrelerinin, PBMC'lerin izolasyonu
- Sağlıklı bağışçılardan (tütün ürünleri tüketicisi olmayanlar) taze kan toplayın: PBMC'leri aşağıda açıklandığı gibi taze kandan izole edin.
- Kan torbası gelmeden önce, 500 ml'lik bir şişe, makas, izolasyon tamponu ve Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (DPBS) (RT) biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) hücre kültürü başlığında hazır bulundurun. İzolasyon tamponu ışıktan korunmalıdır.
- Kan torbasını baş aşağı tutun ve tüpü klemplendiği yerin hemen altından kesin ve en az 3 cm boru bırakın.
- 500 ml'lik şişenin kapağını çıkarın ve tüpü şişe açıklığının üzerinde tutun. Kan torbasını alın ve torba boşalana kadar kanın torbadan şişeye serbestçe akmasını sağlamak için ters çevirin. Kabarcık oluşturmasını önlemek için kanın şişenin iç duvarına akmasına izin verin, bunun yerine düz bir şekilde aşağı doğru akmasına izin verin.
- İzolasyon tamponunu, izolasyon tamponunun kana 1: 5 oranında şişeye dökün. Şişeyi sıkıca kapatın ve uçtan uca 10 kez nazikçe ters çevirin. RT'de 1 saat boyunca ışıklar kapalıyken inkübe etmek için şişeyi hücre kültürü davlumbazında bırakın.
- Kanın üzerinde hafif, saman renginde bir tabaka oluşacaktır. Bu tabakayı 25 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak 50 ml'lik konik tüplere çıkarın. Toplanan miktar, kan bağışında bulunan kişiye bağlı olarak 50 - 300 ml arasında değişebilir.
- Tüpleri RT'de 10 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Koyu kan renginde peleti bırakarak yarı saydam süpernatanı aspire edin. Pelet gevşek fakat viskoz olacaktır.
- 3 ml izolasyon tamponunu 15 ml'lik konik tüplere pipetleyin.
- Yeniden süspanse edilmiş pelete, adım 2.1.5'te toplanan her 50 ml saman renginde sıvı için 20 ml DPBS ekleyin. İyice karıştırmak için girdap yapın ve yeniden askıya alınan sıvıyı birden fazla tüpten birleştirin. Bu sıvı asılı kan hücreleri içerir.
- Bir transfer pipeti ile, 5 ml asılı kan hücrelerini adım 2.1.8'de 3 ml izolasyon tamponuna aktarın. Hücre süspansiyonunu içeren 15 ml'lik konik tüpü iki ayrı katman oluşturmak için yavaşça ve nazikçe eğin. Tüpleri RT'de minimum hızlanma ve frensiz olarak 40 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- PBMC'leri içeren ortaya çıkan bulanık orta tabakayı (buffy coat) 50 ml'lik konik bir tüpe çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın. Altına başka şeffaf katmanlar çizmekten kaçının. Her 50 ml'lik konik tüpe 25 ml'den fazla aktarmayın.
- Hücreleri yıkamak için 25 ml soğuk çalışma tamponu (veya 50 ml konik tüpün kalan tüm hacmini doldurmak için daha fazla) ekleyin. Hücreleri 400 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- Peleti 10 ml çalışma tamponu ile tekrar süspanse edin. Hücreleri sayın ve hemen kullanın veya dondurmak için buzun üzerine koyun.
3. PBMC'lerin Dondurulması ve Çözülmesi
- Adım 2.1.13'te toplanan eripheral kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) 400 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Dondurma kabını üreticinin talimatlarına göre izopropil alkolle doldurun.
Dikkat: İzopropil alkol yanıcı ve akut toksiktir.
- Peleti %20 fetal sığır serumu (FBS) ve %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren RPMI 1640 ortamı (4 °C) ile yeniden süspanse edin. Bu RPMI 1640 dondurma ortamıdır. Peletleri, yaklaşık 5 x 107 hücre/ml'lik bir süspansiyonla sonuçlanacak bir miktarda dondurma ortamı ile yeniden süspanse edin. Dondurma için mevcut hücre sayısı değişecektir.
- 1 ml hücre süspansiyonu alikotunu 2 ml'lik kriyotüplere dağıtın ve kriyotüpleri dondurma kabına yerleştirin. O/N'yi saklamak için kriyotüplü dondurma kabını -80 °C'de bir dondurucuya yerleştirin ve ardından kriyotüpleri çıkarın ve -150 °C ila -190 °C arasında bir kriyojenik dondurucuda saklamak için aktarın.
- Kriyotüpü kriyojenik depodan çıkarın ve 37 °C'de bir su banyosunda hafif çalkalama ile hızla çözün.
- Kriyotüpteki çözülmüş PBMC'leri hemen %10 FBS, %1 Pen/Strep ve %1 L-glutamin içeren 10 ml RPMI 1640 tam besiyerine (4 °C) sahip 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Çözülmüş kriyotüpün içeriği, maksimum hücre canlılığı elde etmek için mümkün olan en kısa sürede aktarılmalıdır.
- PBMC'leri 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- Peletleri 5 ml RPMI 1640 tam ortam ile yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın.
- Tripan mavisi dışlama yöntemi gibi yerleşik yöntemlerle hücre canlılığını ölçün. Genel olarak, bu yöntemle hücre canlılığı yaklaşık% 90 - 95'tir. PBMC'ler artık deneylerde kullanılmaya hazırdır.
4. Hücre İçi Boyama ve Akış Sitometrisi
NOT: Burada listelenen seyreltmeler bu çalışmanın amacı içindir. Seyreltmeler buna göre ayarlanabilir.
- WS-CM'yi RPMI tam ortamı kullanarak 96 oyuklu bir plakada 0.3, 1.56, 3 ve 5 μg/ml eşit nikotin birimi konsantrasyonunda toplam 100 μl/kuyu hacmine seyreltin.
- Aynı plakada, nikotini aşağıdaki konsantrasyonlara seyreltin: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 ve 4000 μg / ml.
Dikkat: Nikotin akut toksiktir ve çevresel olarak tehlikelidir.
- 1 × 106 hücre / kuyu konsantrasyonunda RPMI tam ortamında süspanse edilmiş 100 μl PBMC ekleyin. Hücrelerin toplam hacmi artı WS-CM veya nikotin 200 μl/kuyu olacaktır.
- Plakayı örtün ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 3 saat inkübe edin.
- Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj ederek, süpernatanı aspire ederek, plakanın altını plaka kapalıyken vorteksleyerek ve son olarak hücreleri 200 μl buz gibi soğuk çalışma tamponu ile yeniden süspanse ederek RT'de yıkayın ve yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
- Plakaya 200 μl RPMI tam ortam ekleyin ve yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
- RPMI tam ortamı kullanarak 2 μl/ml GolgiPlug ve 10 μg/ml LPS çalışma konsantrasyonlarını hazırlayın ve her bir oyuğa 200 μl ekleyin.
- Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 6 saat inkübe edin.
- Adım 9.8'in sonunda, hücreleri çalışan tamponla (4 °C) yıkayın ve 4 °C'de 3 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
- Her oyuğa 100 μl Cytofix ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- Hücreleri adım 9.9'da açıklandığı gibi 3 kez, 1x Permwash (4 ° C) ile 300 x g'da 3 dakika boyunca 4 ° C'de yıkayın.
- Her oyuğa 45 μL 1x Cytoperm ve ardından her oyuğa aşağıdaki antikorlardan birinin her birinden 5 μl ekleyin: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri adım 9.9'da anlatıldığı gibi iki kez 1x Permwash (4 °C) ile ve bir kez 300 x g'da çalışan tampon (4 °C) ile 3 dakika boyunca 4 °C'de yıkayın.
- Hücreleri 200 μl% 2 paraformaldehit (4 ° C) ile yeniden süspanse edin. Hücreleri 12 × 75 mm'lik tüplere aktarın ve numuneleri bir akış sitometresinde analiz edin.
Dikkat: Paraformaldehit aşındırıcıdır, akut toksiktir ve sağlık açısından tehlikelidir.
