Staphylococcus aureus ile İn Vitro Biyofilm Sentezi

Özet

Kaynak: Rana, PS ve diğerleri, İnsan Nötrofilleri ve Staphylococcus aureus Biyofilmleri Arasındaki Etkileşimleri Görselleştirmek ve Ölçmek için Standartlaştırılmış İn vitro Testler. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu videoda, poli-L-Lizin kaplı çok kuyulu bir plakada S. aureus tarafından in vitro biyofilmin hazırlanmasını gösteriyoruz. Biyofilm biçimli plaka, sonraki deneyler için kullanılabilir.

Protokol

1. İn vitro biyofilm hazırlanması

1. İzole edilmiş koloniler elde edin S. aureus Tryptic Soya Agar gibi besin açısından zengin bir agar plakası üzerinde bir çizgi plakası tekniği kullanarak dondurularak korunmuş bir stoktan (bkz. Malzeme Tablosu).
2. 96 oyuklu bir plakanın tek tek kuyucuklarını steril H₂O içinde seyreltilmiş 100 μL% 0.001 (h / h) poli-Lizin (PLL) ile kaplayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Aseptik olarak, PLL çözeltisini vakum destekli bir aspirasyon tuzağı kullanarak aspire edin. Kuyuların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin.
   not: Protokoldeki tüm aspirasyon adımları, aksi belirtilmedikçe vakum yardımlı aspirasyon tuzağı kullanılarak gerçekleştirilir.
3. Bir S. aureus kolonisini %2 glikoz ile desteklenmiş minimal esansiyel ortam alfa (MEMα) içinde aşılayarak bir gece kültürü hazırlayın ve 37 ° C'de inkübe edin, 16-18 saat boyunca 200 rpm'de çalkalayın.
4. % 2 glikoz ile desteklenmiş 50 μL ila 5 mL taze MEMα aktararak gece kültürünü seyreltin ve 37 ° C'de, 200 rpm'de çalkalayarak, orta logaritmik faza kadar, genellikle optik yoğunluk 600 (OD_600nm) arasında 0.5-0.8 arasında inkübe edin. Orta logaritmik kültürü 0.1'lik bir OD_600nm'ye normalleştirmek için MEMα kullanın.
5. PLL ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 150 μL normalleştirilmiş kültür aktarın. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir odada 18-20 saat statik olarak inkübe edin
   not: Biyofilmler, μ kanallı slaytlar gibi diğer formatlarda da büyütülebilir (bkz.
6. Planktonik hücreleri çıkarmak için süpernatanı aspire edin. Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için kalan biyokütleyi 150 μL Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile nazikçe yıkayın. Biyofilmi bozmamak için HBSS'yi damla damla ekleyin.
   not: Yıkama sırasında süpernatanı ve HBSS'yi aspire ederken, biyofilm içeren kuyucuklarda biyofilm hala daldırılacak kadar sıvı (süpernatant veya HBSS) bırakın. Bu, biyofilmi yıkamak için damla damla HBSS eklendiğinde biyofilm yapısının bozulmasını önler.
7. Tüm planktonik hücreleri çıkarmak için adım 1.6'yı en az iki kez daha tekrarlayın. Bu noktada, biyofilmler hemen aşağı akış deneyleri için hazırdır.
   not: Biyofilmler nötrofil deneyleri için kullanılmıyorsa, HBSS fosfat tamponlu salin (PBS) ile ikame edilebilir. HBSS, nötrofil aktivasyonu için optimum koşulları sağlayan glikoz dahil olmak üzere bileşenler içerdiğinden, PBS'ye göre HBSS tercih edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BD Bacto Triptik Soya Suyu	Bd	DF0370-07-5	Triptik Soya Agar yapmak için %1,5 agar ile birleştirin
Şeffaf alt 96 oyuklu düz tabanlı polistiren plakalar	Yardımcı yıldız	3370
Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 1x	Corning hücre bakloğu	21-022-Özgeçmiş	Kalsiyum, magnezyum ve fenol kırmızısı içermez
Poli-L-lizin çözeltisi	Sigma	P4707-50ML
Beyaz opak 96 oyuklu plakalar	doğan	353296	Doku kültürü ile tedavi edilmiş ve düz tabanlı plaka
Minimal temel ortam (MEM) Alpha 1x	Gibco (Gibco)	41061-029

adet Serisi