Staphylococcus aureus ile İn Vitro Biyofilm Sentezi

1. İn vitro biyofilm hazırlanması

1. İzole edilmiş koloniler elde edin S. aureus Tryptic Soya Agar gibi besin açısından zengin bir agar plakası üzerinde bir çizgi plakası tekniği kullanarak dondurularak korunmuş bir stoktan (bkz. Malzeme Tablosu).
2. 96 oyuklu bir plakanın tek tek kuyucuklarını steril H₂O içinde seyreltilmiş 100 μL% 0.001 (h / h) poli-Lizin (PLL) ile kaplayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Aseptik olarak, PLL çözeltisini vakum destekli bir aspirasyon tuzağı kullanarak aspire edin. Kuyuların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin.
   not: Protokoldeki tüm aspirasyon adımları, aksi belirtilmedikçe vakum yardımlı aspirasyon tuzağı kullanılarak gerçekleştirilir.
3. Bir S. aureus kolonisini %2 glikoz ile desteklenmiş minimal esansiyel ortam alfa (MEMα) içinde aşılayarak bir gece kültürü hazırlayın ve 37 ° C'de inkübe edin, 16-18 saat boyunca 200 rpm'de çalkalayın.
4. % 2 glikoz ile desteklenmiş 50 μL ila 5 mL taze MEMα aktararak gece kültürünü seyreltin ve 37 ° C'de, 200 rpm'de çalkalayarak, orta logaritmik faza kadar, genellikle optik yoğunluk 600 (OD_600nm) arasında 0.5-0.8 arasında inkübe edin. Orta logaritmik kültürü 0.1'lik bir OD_600nm'ye normalleştirmek için MEMα kullanın.
5. PLL ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 150 μL normalleştirilmiş kültür aktarın. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir odada 18-20 saat statik olarak inkübe edin
   not: Biyofilmler, μ kanallı slaytlar gibi diğer formatlarda da büyütülebilir (bkz.
6. Planktonik hücreleri çıkarmak için süpernatanı aspire edin. Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için kalan biyokütleyi 150 μL Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile nazikçe yıkayın. Biyofilmi bozmamak için HBSS'yi damla damla ekleyin.
   not: Yıkama sırasında süpernatanı ve HBSS'yi aspire ederken, biyofilm içeren kuyucuklarda biyofilm hala daldırılacak kadar sıvı (süpernatant veya HBSS) bırakın. Bu, biyofilmi yıkamak için damla damla HBSS eklendiğinde biyofilm yapısının bozulmasını önler.
7. Tüm planktonik hücreleri çıkarmak için adım 1.6'yı en az iki kez daha tekrarlayın. Bu noktada, biyofilmler hemen aşağı akış deneyleri için hazırdır.
   not: Biyofilmler nötrofil deneyleri için kullanılmıyorsa, HBSS fosfat tamponlu salin (PBS) ile ikame edilebilir. HBSS, nötrofil aktivasyonu için optimum koşulları sağlayan glikoz dahil olmak üzere bileşenler içerdiğinden, PBS'ye göre HBSS tercih edilir.