Patojenik Bakteriler Yoluyla Lenfositleri Uyarmak için İn Vitro Teknik

Özet

Kaynak: Dousha, L., et al. Haemophilus influenzae'ye Karşı Solunum Yolu İmmün Yanıtlarının Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, tiplenemeyen Haemophilus influenzae (NTHi) yoluyla lenfositleri uyarmak ve bağışıklık tepkisini değerlendirmek için in vitro bir tekniği göstermektedir. İzole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) NTHi ile inkübe edilmesi, bakteri hücrelerinin T lenfositlerini uyarmasına neden olarak sitokin üretimine yol açar. Sitokinlerin sekresyonunu inhibe ettikten sonra, uyarılmış T lenfositlerinde biriken hücre içi sitokinleri tespit etmek için immünofloresan boyama yapılır.

Protokol

1. Antijenik preparat

NOT: Hi'ye karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için üç farklı antijenik preparat kullanılabilir. Bunlar 1) bir hücre altı bileşendir (tipik olarak bakteri hücre duvarından); 2) öldürülmüş ve etkisiz hale getirilmiş bakteriler; ve 3) canlı bakteri. Herhangi bir deneye başlamadan önce her bir antijenik preparatın kullanımını belirleyin.

1. Hücre altı bileşenler
   1. Ticari müstahzarlar, şirket içi geliştirilen bileşenler ve/veya diğer araştırmacılar dahil olmak üzere kaynaklardan hücre altı bileşenler elde edin.
      not: Genellikle bakteri hücre duvarından elde edilen hücre altı bileşenler kullanılabilir ve P6 ve lipooligosakkarit (LOS) gibi dış zar proteinlerini içerir. Bu hücre altı bileşenler genellikle uzmanlaşmış merkezlerde türetilir. Nasıl yapıldığının açıklaması bu makalenin kapsamı dışındadır. Bu bileşenleri elde etmek için bu alandaki uzmanlarla doğrudan temas kurulması önerilir.
2. Öldürülen/inaktive edilen bakteriler
   1. Bakterileri uygun numuneden alın (örneğin, balgam veya bronkoskopi). Uygun bir mikrobiyoloji laboratuvarı kullanarak suşu H. influenzae olarak onaylayın. Tiplendirilemezler olduklarını doğrulamak için H. influenzae örneklerinin tiplendirilmesini gerçekleştirin (NTHi, uzman bir mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından).
   2. Temsili bir antijen elde etmek için, havuzlanmış bir antijen yapmak için birden fazla NTHi suşu (en az 5, her biri yaklaşık olarak aynı miktarda) kullanın. Suşları -70 °C'de mikrosantrifüj tüplerinde gliserol suyunda saklayın.
      not: Bu deneyde on farklı suş kullanıldı.
   3. Suşları (her seferinde bir mikrosantrifüj tüpü) çikolatalı agar plakalarına çözün ve gece boyunca %5 CO₂ içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde büyütün. Bakterileri 500 μL fosfat tamponlu tuzlu suya (PBS) ekleyin ve iki kez yıkayın (5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün). NTHi'yi 10⁸ mL'lik bir konsantrasyona (5 mL'lik bir kap veya eşdeğeri kullanarak) alikot etmek için bir MacFarland standardı veya bir spektrofotometre kullanın.
   4. Isı, bakterileri 10 dakika boyunca 56 °C sıcaklıktaki bir su banyosuna koyarak etkisiz hale getirir.
   5. 30 saniye boyunca düşük-orta aralıkta bir hızda sürekli bir sonikasyon ayarı kullanarak bakterileri sonikleştirin.
   6. Uygun hacimdeki numuneleri mikrosantrifüj tüplerine alın. 10⁸ mL'lik bir numune için, 50 μL'lik alikotlar kullanın (yani, mL başına 20 numune) ve bunları gerekene kadar -70 ° C'de dondurun.
3. Canlı bakteriler
   1. İlk olarak, adım 1.2.1'de belirtildiği gibi canlı bakterileri karakterize edin. İyi karakterize edilmiş bir suş kullanın. Suşun ayrıca yedek olarak -70 °C'de gliserol suyunda saklandığından emin olun.
   2. Bakterileri çikolatalı agar plakaları gibi zenginleştirilmiş ortamlarda veya et suyunda büyütün.
      1. Çikolatalı agar plakalarını kullanmak için bakterileri steril yayıcılarla en az 3-4 günde bir yayın.
      2. Alternatif olarak, bakterileri büyütmek için X (hemin) ve V (β-nikotinamid adenin dinükleotid) faktörleri ile zenginleştirilmiş Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) suyu kullanın. NTHi'yi hem hemin hem de β-nikotinamid adenin dinükleotidi (her ikisi de 10 μg / mL) ile desteklenmiş 5-10 mL BHI suyunda gece boyunca plakalardan aşılayın ve %5'lik bir CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca kültür.
         not: Bu, tekrarlanabilirlik, daha yüksek koloni oluşturan birimler (CFU) sayıları ve tüm bakterilerin benzer bir log büyümesi aşamasında olması avantajına sahiptir (plakalarda, kültürdeki konuma bağlı olarak bakteri canlılığı daha büyük olabilir).
   3. Hücresel canlılığı korurken güçlü bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için bir hücrede 100 bakteriden oluşan çok sayıda enfeksiyon (MOI) kullanın. Bakteri sayısını değerlendirmek için MacFarland Standard veya spektrofotometre kullanın.
   4. Canlı NTHi tahlilleri için kullanılan ortamın herhangi bir insan serumu içermediğinden emin olun, çünkü bu bakterileri öldürecektir. Hayvan serum örnekleri (ör. fetal buzağı serumu) genellikle herhangi bir soruna neden olmaz.
      not: Periferik kan, bronkoskopi örnekleri (özellikle bronkoalveoler lavaj (BAL)) ve rezeke edilmiş akciğer dokusu gibi standart doku örneklerini analiz etmek için aşağıda açıklanan yöntemleri kullanın. Örnekleri Hi antijen ile 10 dakika ila 24 saat veya daha fazla inkübe edin.

2. Periferik kanda lenfosit fonksiyonunun değerlendirilmesi

1. Akış sitometrisi tahlilleri için tam kan veya mononükleer hücre preparatları kullanın.
2. Damar delme ile her konudan örnekler alın. Bir lityum heparin tüpündeki periferik bir damardan 4 mL kan toplayın ve örnekleri kontrol ve antijen stimülasyonu için alikotlara bölün.
3. Her iki örneğe de kostimülatör antikorlar (anti-CD28 ve CD49d, 1 μL/mL) ekleyin. Antijen örneğine NTHi ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de 1 saat inkübe edin. Öldürülen NTHi preparatı için, 2 mL kana 200 μL antijen ekleyin. Canlı NTHi için, beyaz hücrelere 100: 1'lik bir MOI'de canlı NTHi hücreleri ekleyin (hemositometre ile ölçüldüğü gibi).
4. Golgi bloke edici ajan Brefeldin A'yı (10 μL/mL) numunelere ekleyin ve 5 saat daha
   için inkübe edin not: Golgi aygıtının bloke edilmesi, sitokinlerin hücre dışına ihraç edilmesini önler.
5. Tam kan kullanılıyorsa, çözeltide sadece lökositler bırakmak için eritrositleri% 0.8 amonyum klorür ile parçalayın. Lökositleri 1 saat boyunca 500 μL %1-2 paraformaldehit kullanarak sabitleyin.
6. Hücreleri hemositometre ile sayın, 10^μL% 0.1 saponin ile 10 6 hücreyi 15 dakika boyunca geçirgen hale getirin ve hücreleri floresan etiketli antikorlarla inkübe edin. Hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.
   not: Floresan etiketli antikorların miktarı, her sitokin için spesifik olacaktır. Üreticinin talimatlarına uyun. Tipik olarak, 100 μL çözelti içindeki 10⁶ hücre 1 saat boyunca boyanacaktır. Ticari olarak elde edilen antikorların çoğu 25-100 test yapmak için yeterli olacaktır.
7. Şekil 1'de gösterildiği gibi ilgili lenfosit popülasyonunu (hücreler CD45, daha sonra CD3 ve daha sonra CD4 veya CD8 ekspresyonu ile kaplanır) geçit yaparak antijene yanıt veren hücrelerin oranını belirleyin. Tüm sitokinlerin analiz edilmesi için uyarılmamış hücreler üzerinde arka plan boyama yapın. Hem uyarılmış hücreler hem de kontrol için her sitokini analiz etmek için 100.000 hücreyi tarayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Akciğer dokusunda sitokin üretimi. Hücreler ilk olarak akış sitometrisi kullanılarak lökosit markörü CD45 (A) ekspresyonu için analiz edilir. Bu popülasyon daha sonra CD3 ekspresyonu (B) ve CD4 / CD8 ekspresyonu (C) için daha fazla analiz edilir. CD3/CD4+ hücreleri, kontrol (D) ve NTHi ile uyarılmış örneklerde (E

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amonyum klorür	Sigma Aldrich	213330
Brefeldin Belediyesi	Sigma Aldrich	B6542
CD28	Termo Balıkçı	16-0289-81
CD49d	Termo Balıkçı	534048
Saponin	Sigma Aldrich	8047152

· · Serisi Serisi ·