$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Antijenik preparat
- Canlı bakteriler
- İlk olarak, canlı bakterileri karakterize edin. Bakterileri uygun numuneden alın (örneğin, balgam veya bronkoskopi). Uygun bir mikrobiyoloji laboratuvarı kullanarak suşu Haemophilus influenzae olarak onaylayın. Tiplendirilemezler olduğunu doğrulamak için H. influenzae örneklerinin tiplendirilmesini gerçekleştirin (uzman bir mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından). İyi karakterize edilmiş bir suş kullanın. Suşun ayrıca yedek olarak -70 °C'de gliserol suyunda saklandığından emin olun.
- Bakterileri çikolatalı agar plakaları gibi zenginleştirilmiş ortamlarda veya et suyunda büyütün.
- Çikolatalı agar plakalarını kullanmak için bakterileri steril yayıcılarla en az 3-4 günde bir yayın.
- Alternatif olarak, bakterileri büyütmek için X (hemin) ve V (β-nikotinamid adenin dinükleotid) faktörleri ile zenginleştirilmiş Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) suyu kullanın. Yazılamayan H. influenzae'yi (NTHi) hem hemin hem de β-nikotinamid adenin dinükleotid (her ikisi de 10 μg / mL) ile desteklenmiş 5-10 mL BHI suyunda gece boyunca plakalardan aşılayın ve 37 ° C'de gece boyunca% 5 karbondioksit, CO2 inkübatörde kültür.
not: Bu, tekrarlanabilirlik, daha yüksek koloni oluşturan birimler (CFU) sayıları ve tüm bakterilerin benzer bir log büyümesi aşamasında olması avantajına sahiptir (plakalarda, kültürdeki konuma bağlı olarak bakteri canlılığı daha büyük olabilir).
- Hücresel canlılığı korurken güçlü bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için bir hücrede 100 bakteriden oluşan çok sayıda enfeksiyon (MOI) kullanın. Bakteri sayısını değerlendirmek için MacFarland Standard veya spektrofotometre kullanın.
- Canlı NTHi tahlilleri için kullanılan ortamın herhangi bir insan serumu içermediğinden emin olun, çünkü bu bakterileri öldürecektir. Hayvan serum örnekleri (ör. fetal buzağı serumu) genellikle herhangi bir soruna neden olmaz.
NOT: Periferik kan, bronkoskopi örnekleri (özellikle bronkoalveoler lavaj (BAL)) ve rezeke edilen akciğer dokusu gibi standart doku örneklerini analiz etmek için aşağıda açıklanan yöntemleri kullanın. Örnekleri Hi antijen ile 10 dakika ila 24 saat veya daha fazla inkübe edin.
2. Akciğer dokusunda lenfosit fonksiyonunun/inflamatuar mediatörlerin değerlendirilmesi
- Bronkoskopiden yeterli lenfosit elde etmek genellikle mümkün değildir; bu nedenle, lobektomi örneklerinden akciğer dokusunu kullanın. Akciğer dokusu örneklerinin optimizasyonu, anatomik patoloji servisi ile yakın ilişki gerektirir. Dokunun tümörden en az 3 cm'lik bir kenara sahip olduğundan ve önemli amfizem içermeyen hücresel doku olduğundan emin olun (patolog tarafından belirlendiği gibi).
- Akış sitometrisi tahlilleri için kullanılmadan önce akciğer dokusunu hücresel bir süspansiyona ayırın. Akciğer dokusunu kimyasal olarak sindirin (örneğin kollajenaz ile) veya mekanik olarak ayrıştırın.
not: Dokunun mekanik olarak ayrıştırılması, hücrelerin daha iyi yüzey boyaması ile ilişkili olduğu için tercih edilebilir (örneğin, CD3 / 4 etiketlemesi).
- Bir patologdan lobektomi örnekleri alın (genellikle akciğer kanseri tedavisi gören hastalardan elde edilir). Numunenin yaklaşık 20-40 g'ını 3-5 mm'lik3 bölüme dilimleyin. Uygun bir ayrıştırıcı kullanılarak mekanik olarak parçalanmadan önce bunları 50 μL'lik steril bir hazneye yerleştirin.
- Doku ayrışmasından sonra, eritrositleri 10: 1 (yani 5 mL)% 0.8 amonyum klorür (150 mM amonyum klorür (NH4Cl), 1 mM sodyum bikarbonat (NaHCO3) ve 0.1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi.
not: Alternatif olarak, Q-prep gibi otomatik bir sistem kullanılabilir.
- Hücreleri steril RPMMI'de yeniden süspanse edin (hacim hücre sayılarına bağlı olacaktır ve genellikle 10-20 mL'dir) ve ardından bunları 100 μm steril bir naylon ağdan süzün. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın.
>3. NTHi enfeksiyon testi
- Akciğer hücrelerini, tüp başına 4 x 106 hücre / mL'lik bir nihai hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse edin (kontrol ve uyarılmış numuneler).
- (Negatif) kontrol tüpü için 1 mL RPMI'de 4 x 106-6 x10 6 hücreli bir süspansiyon kullanın. NTHi tüpü için aynı miktarı kullanın (herhangi bir ek numune, Stafilokok süperantijen E (SEB) ile pozitif kontrol olarak kullanılabilir). NTHi tüpündeki hücreleri, hücre başına 100 bakterilik bir MOI'de enfekte edin. Tüplerde gaz transferine izin vermek için kapağı yarım tur gevşetin.
- Hücreleri bir tüp döndürücüye yerleştirin ve 12 rpm'de döndürürken 37 °C'de inkübe edin.
- Sitokinlerin hücre dışı ihracatını önlemek için, stimülasyondan 1 saat sonra 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar hücre süspansiyonlarına bir Golgi blokeri (Brefeldin A) ekleyin. Hücre süspansiyonlarını rotasyonda 16-22 saatlik bir inkübasyon için geri koyun.
- Hücre süspansiyonunu% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.01 sodyum azid, NaN3 içeren 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Hücre içi sitokin boyaması için antikorları ekleyin (antikor seçimi araştırmacı tarafından belirlenecektir). Spesifik insan lenfosit hücre yüzeyi belirteçleri (örn., CD45, CD3, vb.) için hücre süspansiyonunu 1 saat boyunca boyayın. Hücreleri PBS ile yıkayın, sabitleyin ve geçirgen hale getirin.
- Hücreleri 1 saat boyunca 500 μL %1-2 paraformaldehit kullanarak sabitleyin.
- Hücreleri hemositometre ile sayın, 10μL% 0.1 saponin ile 10 6 hücreyi 15 dakika boyunca geçirgen hale getirin ve hücreleri floresan etiketli antikorlarla inkübe edin. Hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.
not: Floresan etiketli antikorların miktarı, her sitokin için spesifik olacaktır. Üreticinin talimatlarına uyun. Tipik olarak, 100 μL çözelti içindeki 106 hücre 1 saat boyunca boyanacaktır. Ticari olarak elde edilen antikorların çoğu 25-100 test yapmak için yeterli olacaktır.
- Hücreleri hücre içi sitokin boyama antikorları ile inkübe edin (ör., interferon-gama, IFN-γ ve tümör nekroz faktörü beta, TNF-α veya interlökin, IL-13 ve IL-17A) 1 saat
not: Fiksasyon, antikorların bağlandığı yüzey proteinlerinde konformasyonel değişikliklere neden olabileceğinden, önce yüzey belirteçlerinin, ardından hücre içi boyanması önerilir.
- Hücreleri 500 μL PBS ile yıkayın ve bir akış sitometresinde veri toplamadan önce 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin.