Opsonize Biyofilm ile Etkileşim Üzerine Nötrofiller Tarafından ROS Üretiminin Belirlenmesi

Özet

Kaynak: Rana, PSJB, et al. İnsan Nötrofilleri ve Staphylococcus aureus Biyofilmleri Arasındaki Etkileşimleri Görselleştirmek ve Ölçmek için Standartlaştırılmış In vitro Tahliller. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu videoda, opsonize bir bakteriyel biyofilme maruz kaldıktan sonra nötrofiller tarafından reaktif oksijen türlerinin oluşumunu tespit etmek için bir in vitro kemilüminesans testi gösteriyoruz.

Protokol

>1. Nötrofiller tarafından üretilen ROS'un ölçümü

1. Yıkanmış biyofilme damla damla 100 μL% 20 normal insan serumu (HBSS içinde seyreltilmiş) ekleyin ve biyofilmi opsonize etmek için statik koşullar altında 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
2. % 20'lik serum solüsyonunu aspire edin ve biyofilmleri bir kez 150 μL HBSS ile damla damla yıkayın. HBSS'yi aspire edin ve opsonize biyofilmlerle kuyuları geride bırakın.
   not: Deneyin yorumlanması için en az dört grup önerilir: (A) Nötrofiller + Biyofilm, (B) Nötrofiller + PMA (pozitif kontrol, Malzeme Tablosuna bakınız), (C) Sadece nötrofiller ve (D) Sadece biyofilm.
3. HBSS'de yeniden süspanse edilen nötrofillere, nihai luminol konsantrasyonu 50 μM olacak şekilde 4 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda luminol ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Bu çözüm (A) ve (C) grupları için kullanıma hazırdır. Luminol ile karıştırılmış 4 x 10⁵ nötrofilleri opsonize biyofilmler ile kuyucuklara ekleyin.
4. Ayrı bir tüpte, herhangi bir nötrofil içermeyen HBSS içinde 50 μM luminol çözeltisi hazırlayın ve bunu kuyu içeren biyofilme (D grubu) ekleyin.
5. 350 μL nötrofilleri luminol ile karıştırın ve karışıma 500 ng/mL'lik bir nihai konsantrasyonda forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ekleyin. (B) grubu için, bu karışımdan 4 x 10⁵ nötrofil biyofilm içermeyen kuyucuklara ekleyin. Bu pozitif bir kontrol görevi görür.
   not: Bu adımda belirtilen PMA konsantrasyonu, PMA ile uyarılan nötrofiller pozitif bir kontrol olduğundan, sağlam bir patlama tepkisi sağlamak için nispeten yüksektir. PMA, deneye bağlı olarak nötrofilleri aktive etmek için daha düşük bir konsantrasyonda kullanılabilir.
6. Plakayı 270 °C'de 30 saniye boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
7. Plaka okuyucunun, 37 dakikalık aralıklarla 60 dakika boyunca lüminesans ve kinetik okuma ayarıyla birlikte 3 °C'ye ayarlandığından emin olun. 60 dk.
   boyunca nötrofillerle ROS üretimini ölçmek için plakayı plaka okuyucuya yerleştirin not: Bu test için, biyofilmler, lüminesans testleri için kullanılan beyaz plakalarda büyütüldü. PMA, oksidatif patlama yanıtı için bilinen bir agonisttir. PMA içeren çalışmalar yapılırken, PMA hemen patlama yanıtını başlattığından, nötrofil içeren çözelti soğukken son adımda PMA'nın eklendiğinden emin olun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
50 mL konik santrifüj tüpleri	Termo Bilimsel	339652
Alkollü çubuk	Bd		Kan alımı için kullanılır
Hücre sayacı	Bal Tedarik	202C
Şeffaf alt 96 oyuklu düz tabanlı polistiren plakalar	Yardımcı yıldız	3370
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) 1x	Gibco (Gibco)	14190-144
Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 1x	Corning hücre bakloğu	21-022-Özgeçmiş	Kalsiyum, magnezyum ve fenol kırmızısı içermez
Hemositometre	Parlak Çizgi
Aydınlatma	Sigma	A8511-5G
Minimal temel ortam (MEM) Alpha 1x	Gibco (Gibco)	41061-029
Normal insan serumu	Kompleman Teknolojisi	Nhs
Petri Kabı (100 x 15 mm)	VWR (VWR)	25384-342
Phorbol 12-miristat 13-asetat
Poli-L-lizin çözeltisi	Sigma	P4707-50ML
SoftMax Pro Yazılımı	Moleküler Cihazlar		Veri toplama için kullanılan mikroplaka okuyucu yazılımı
SpectraMax i3x	Moleküler Cihazlar		Mikroplaka okuyucu

adet Serisi