$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. İn vitro biyofilm hazırlanması
- İzole edilmiş koloniler elde edin S. aureus Tryptic Soya Agar gibi besin açısından zengin bir agar plakası üzerinde bir çizgi plakası tekniği kullanarak dondurularak korunmuş bir stoktan (bkz. Malzeme Tablosu).
- 96 oyuklu bir plakanın tek tek kuyucuklarını steril H2O içinde seyreltilmiş 100 μL% 0.001 (h / h) poli-Lizin (PLL) ile kaplayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Aseptik olarak, PLL çözeltisini vakum destekli bir aspirasyon tuzağı kullanarak aspire edin. Kuyuların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin.
not: Protokoldeki tüm aspirasyon adımları, aksi belirtilmedikçe vakum yardımlı aspirasyon tuzağı kullanılarak gerçekleştirilir.
- Bir S. aureus kolonisini %2 glikoz ile desteklenmiş minimal esansiyel ortam alfa (MEMα) içinde aşılayarak bir gece kültürü hazırlayın ve 37 ° C'de inkübe edin, 16-18 saat boyunca 200 rpm'de çalkalayın.
- % 2 glikoz ile takviye edilmiş 50 μL ila 5 mL taze MEMα aktararak gece kültürünü seyreltin ve 37 ° C'de, 200 rpm'de çalkalayarak, orta logaritmik faza kadar, genellikle optik yoğunluk 600 (OD600nm) arasında inkübe edin 0.5-0.8. Orta logaritmik kültürü OD600nm'lik 0.1'e normalleştirmek için MEMα kullanın.
- PLL ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 150 μL normalleştirilmiş kültür aktarın. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir odada 18-20 saat statik olarak inkübe edin
not: Biyofilmler, μ kanallı slaytlar gibi diğer formatlarda da büyütülebilir (bkz.
- Planktonik hücreleri çıkarmak için süpernatanı aspire edin. Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için kalan biyokütleyi 150 μL Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile nazikçe yıkayın. Biyofilmi bozmamak için HBSS'yi damla damla ekleyin.
not: Yıkama sırasında süpernatanı ve HBSS'yi aspire ederken, biyofilm içeren kuyucuklarda biyofilm hala daldırılacak kadar sıvı (süpernatant veya HBSS) bırakın. Bu, biyofilmi yıkamak için damla damla HBSS eklendiğinde biyofilm yapısının bozulmasını önler.
- Tüm planktonik hücreleri çıkarmak için adım 1.6'yı en az iki kez daha tekrarlayın. Bu noktada, biyofilmler hemen aşağı akış deneyleri için hazırdır.
not: Biyofilmler nötrofil deneyleri için kullanılmıyorsa, HBSS fosfat tamponlu salin (PBS) ile ikame edilebilir. HBSS, nötrofil aktivasyonu için optimum koşulları sağlayan glikoz dahil olmak üzere bileşenler içerdiğinden, PBS'ye göre HBSS tercih edilir.
2. Nötrofil izolasyonu
NOT: Nötrofiller, daha önce yayınlanmış bir yöntem izlenerek küçük değişikliklerle izole edildi. Bu izolasyon protokolü, önce yoğunluk gradyan santrifüjlemesini, ardından %3 dekstran sedimantasyonunu birleştirir. Bu bölüm, yayınlanan protokolde yapılan değişikliklere odaklanarak yalnızca genel nötrofil izolasyon protokolünü kapsar. Ayrıca, aşağıda özetlenen protokol, nötrofilleri izole edebilen ve gerektiğinde ikame edilebilen birçok yöntemden biridir. Nötrofilleri izole etmek için diğer yöntemler arasında hücre ayırma ortamının kullanılması veya manyetik antikor hücre ayrılması yer alır.
- Kurumsal IRB'de belirtilen protokole göre, damar delinmesi yoluyla yetişkin bir donörden kan alın. Kan alımından önce, şırınganın nihai heparin konsantrasyonu 20 U / mL olacak şekilde yeterli koruyucu içermeyen heparin içerdiğinden emin olun.
- Heparinize kanı, oda sıcaklığında H2O'da endotoksin içermeyen% 0.9 NaCl hacminin 3/4'ü ile seyreltin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Seyreltilmiş kan örneğinin her 20 mL'si için, 50 mL'lik taze bir konik tüpte ticari olarak temin edilebilen bir yoğunluk gradyan ortamının (Malzeme Tablosuna bakınız) 14 mL'sini alikotlayın. Seyreltilmiş kan örneğini yoğunluk gradyan ortamının üzerine dikkatlice katmanlayın.
- Katmanlı kan örneğini oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra tabakayı rahatsız etmemek için santrifüjün yavaş bir kırılmaya sahip olduğundan emin olun.
not: Kan örneği, bir salin ve plazma karışımı, bir mononükleer hücre katmanı, bir yoğunluk gradyan ortamı, nötrofiller ve eritrositler içeren beş katmana sahip olacaktır.
- Serolojik bir pipet kullanarak, nötrofillerin ve eritrosit peletinin üzerindeki tüm katmanları aspire edin, ardından peletinH2O'dasoğuk endotoksin içermeyen% 0.9 NaCl içinde nazikçe yeniden süspansiyonunu yapın. 20 mL'lik bir kan örneğinden üretilen her pelet için, peleti toplam 20 mL hacme kadar yeniden süspanse edin. 1: 1 hacimde% 3 dekstran ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Tüpü buz üzerinde 18-20 dakika dik olarak inkübe edin.
not: % 3 dekstranın H2O'da endotoksin içermeyen% 0.9 NaCl ile yapıldığından emin olun.
- Nötrofiller ve bazı eritrositler içeren üst tabakanın 20 mL'sini yeni bir 50 mL'lik konik tüpe çıkarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 355 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve geride kırmızı bir pelet bırakın.
- Kalan eritrositleri parçalamak için peleti 10 mL soğuk, steril H2O'da 30 saniye boyunca nazikçe yeniden süspanse edin. Tonisiteyi eski haline getirmek için karışıma hemen 10 mL soğuk endotoksin içermeyen% 0.9 salin ekleyin. Çözeltiyi 233 x g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı dökün ve kan örneğinin 20 mL'si başına 1 mL soğuk HBSS'de% 95 -% 97 nötrofil içeren peleti yeniden süspanse edin.
- 10 μL'lik yeniden süspanse edilmiş nötrofilleri 90 μL'lik %0.4 tripan mavisi dışlama boyasına aktarın ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın (bkz. Malzeme Tablosu).
not: Canlı hücrelerde tripan mavisi dışlama boyası geçirimsiz olduğundan, canlı olmayan hücreler maviye boyanır. Bu protokol %>99 hücre canlılığı sağlar.
- Nötrofillerin nihai konsantrasyonu 4 x 106 hücre / mL olacak şekilde ek HBSS ekleyin.
not: %<99 hücre canlılığına sahip örnekler için, 4 x 106 hücre / mL'lik nihai konsantrasyon hala elde edilebilir; bununla birlikte, elde edilen 4 x 106 hücre / mL içeren çözeltinin toplam hacmi azalacaktır. Nötrofillerin nihai konsantrasyonu, kullanıcının deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Nötrofiller, aşağıda açıklanan tüm deneyler için 4 x 106 hücre / mL nihai konsantrasyonda yeniden süspanse edildi. Donörden donöre değişkenliği hesaba katmak için, nötrofillerle ilgili tüm deneylerin en az üç farklı donörle yapılması şiddetle tavsiye edilir.
>3. Biyofilm-nötrofil etkileşimlerinin görüntülenmesi
- 1.2-1.6 adımlarını kullanarak bir biyofilm oluşturun. Biyofilm görüntülemeyi kolaylaştırmak için, mikroskopi görüntülemenin kolaylığını artırmak için USA300 eksprese eden yeşil floresan proteini (GFP) gibi bir floresan S. aureus suşu kullanın.
not: İn vitro biyofilm modelini göstermek için 96 oyuklu bir plaka yerine 6 μ kanallı bir slayt (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıldı (adım 1).
- 4 x 106 hücre / mL nötrofili 100 μM Mavi CMAC (7-amino-4-klorometilkumarin) Boya (BCD, Malzeme Tablosuna bakınız) ile 37 ° C ve% 5 CO2'de bir külbütörde 30 dakika inkübe edin. Numunelerin karanlıkta inkübe edildiğinden emin olun ve kalan adımlar için ışığa maruz kalmayı sınırlayın.
- Fazla BCD'yi yıkamak için, nötrofilleri 5 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Nötrofilleri taze HBSS'de yeniden süspanse edin. Bu noktada, nötrofil ve bakteri ölümünü izlemek için 4 μM'lik bir son konsantrasyonda BCD ile boyanmış nötrofillere etidyum homodimer-1 (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- μ slaytlar halinde büyütülen S. aureus biyofilmine 150 μL nötrofil ekleyin, böylece nötrofil/bakteri oranı 1:30 (nötrofil: bakteri). μ slaytları nemlendirilmiş bir odada 30 dakika inkübe edin. Bakteri hücrelerinin sayısı, 18 saatlik bir biyofilmin kaplanmasından elde edilen hücre sayılarına dayanmaktadır.
- Floresan boyaların/proteinlerin uyarma ve emisyon dalga boylarına karşılık gelen floresan kanalları kullanarak nötrofil-biyofilm etkileşimini görüntüleyin.
not: Bu çalışma için BCD 353/466 nm, etidyum homodimer-1 528/617 nm ve GFP 395/509 nm'dir. Numunelerin foto-ağartılmasını önlemek için numunenin lazere veya ışığa maruz kalmasını sınırlayın.
- Mikroskopi görüntü analiz yazılımı veya FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ ve BAIT gibi programları ve daha fazlasını kullanarak görüntüleri analiz edin.
not: Lekelerle çalışırken, kullanılan boyaların özgüllüğünü dikkate almak önemlidir. Bazı lekeler prokaryotik ve ökaryotik hücreler üzerinde çalışırken, diğerleri sadece bir tanesinde çalışır. Nötrofiller ve biyofilmler, her iki hücre tipini de lekeleyebilen boyalar kullanılarak ayrı ayrı boyanırsa, çapraz lekelenmeyi önlemek için nötrofilleri ve biyofilmleri birleştirmeden önce kalan boyayı yıkadığınızdan emin olun.