Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Farelerin ve DSS'nin Hazırlanması
- Nakavt (α-gustducin-/-) fareleri ve yaş, cinsiyet ve vücut ağırlığı uyumlu vahşi tip kontrol (α-gustducin+/+) C57BL/6 fareleri ayrı ayrı temiz kafeslerde saklayın.
not: Nakavt fareler, 20 nesilden fazla bir süredir C57BL / 6 fareleri ile geri çaprazlanmıştır ve yaklaşık% 100 C57BL / 6 genetik geçmişine sahiptir.
- 30 g dekstran sülfat sodyum (DSS) tozunu 1 L otoklavlanmış suda çözün. Nihai çalışma konsantrasyonunun %3 (a/h) olduğundan emin olmak için çözelti berraklaşana kadar karıştırın.
not: DSS solüsyonu oda sıcaklığında 1 haftaya kadar veya kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir.
>2. Farelerde DSS Kolitinin İndüksiyonu ve Değerlendirilmesi
- Her farenin başlangıçtaki vücut ağırlığını tartın ve kaydedin. Fareleri ayrı ayrı standart plastik kafeslere yerleştirin ve kafesleri etiketleyin.
- Normal içme suyunu, her iki fare grubunun da ad libitum'a erişebildiği toplam 7 gün boyunca% 3 DSS çözeltisi ile değiştirin.
- Farenin vücut ağırlığını ölçün, DSS solüsyonu tüketimini kaydedin ve DSS uygulaması sırasında her farenin dışkısını günlük olarak toplayın ve inceleyin. İshal ve rektal kanamanın şiddetini gözlemleyin ve bunu DSS'nin neden olduğu hastalık indeksine dönüştürün.
- Deney sırasında, kolit semptomlarını değerlendirmek için başlangıç ağırlığına kıyasla kilo kaybı yüzdesi ve hastalık indeksi hesaplanır.
not: Hastalık indeksi, ishal ve rektal kanama gözlemlerinin birleştirilmesiyle puanlanır ve şu şekilde tanımlanır: 0 (normal dışkı, kan yok), 1 (yumuşak dışkı, kan yok), 2 (yumuşak dışkı, az kan), 3 (çok yumuşak dışkı, hafif kanama) ve 4 (sulu dışkı, belirgin kanama). Hastalık indeksi her fare için günlük olarak analiz edilir.
- 7 günlük DSS tedavisinin sonunda, fareleri servikal çıkık ile feda edin ve kalan deneylere devam edin.
3. Doku Örneklerinin Hazırlanması
- Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve karın derisini% 70 etanol ile temizleyin. Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için küçük bir makasla karın bölgesinde 3 cm uzunluğunda orta hat kesisi yapın.
- Dalağı diğer dokulardan dikkatlice ayırmak için bir çift forseps kullanın, ardından dalağı çıkarın ve boyutunu ölçün.
- Kolonu forseps ile tanımlayın ve kaldırın ve çevredeki mezenterden ayırın. Çekum ve rektum görünene kadar tüm kolonu dışarı çekin.
- Sırasıyla proksimal ve distal kolonu serbest bırakmak için kolonu kolonoçekal kenarda ve pelvisin derinliklerinde keserek izole edin. Ardından, izole edilmiş kolonun uzunluğunu ölçün ve kaydedin. Diseksiyon işlemi sırasında kolon dokusuna zarar vermemeye dikkat edin.
- Kolonu 10 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile 10 mL'lik bir şırınga ile yıkayın ve elüat tamamen berraklaşana kadar dışkıyı ve kanı çıkarmak için bir gavaj iğnesi ile donatın.
- Histolojik tanımlama için, doku örneklerini eşit olarak üç kısma bölün: proksimal, orta ve distal. Ardından, dokuyu gece boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
- Sitokin ekspresyonunun analizi için, tüm kolonu sıvı nitrojen ile hızlı bir şekilde dondurun ve kullanılana kadar -80 ° C'de saklayın.
4. DSS'ye Bağlı Kolitin Şiddetinin Histolojik Değerlendirmesi
- İmmünohistokimya
- Fiksasyondan sonra, numuneleri kriyoproteksiyonla korumak için dokuyu gece boyunca 15 mL'lik bir tüpte 1x PBS'de% 30 sükroz çözeltisine batırın.
- Dokuyu optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün ve OCT sertleşene kadar -20 °C'ye yerleştirin.
- Dokuyu içeren OCT bloğunu bir kriyostata aktarın, kriyostattaki kalınlık kadranını 12 μm'ye ayarlayın ve 12 μm kalınlığındaki donmuş bölümleri dilimleyin ve toplayın.
- Toplanan doku kesitlerini bir kriyostattan 65 °C'de 20 dakika sıcak bir plaka üzerinde ısıtın. Bölümleri 1x PBS'de her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Endojen peroksidazı ortadan kaldırmak için doku bölümlerini% 3 hidrojen peroksit içinde 10 dakika inkübe edin. Bölümleri 3 kez daha yıkayın. Dokuları bloke edici tampon (% 3 sığır serum albümini (BSA),% 0.3 iyonik olmayan deterjan,% 2 keçi serumu,% 0.1 sodyum azid) ile oda sıcaklığında 1 saat veya daha uzun süre bloke edin.
- Bloke edici tamponu, aşağıdaki bağışıklık hücresi tipine özgü birincil antikorları içeren bir çözelti ile değiştirin: lökositler için CD45, T hücreleri için CD3, B hücreleri için B220, makrofajlar için CD11b ve nötrofiller için Ly6G. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Primer antikorları aspirasyon ile doku bölümlerinden çıkarın. Bölümleri 1x PBS ile her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Bölümleri biyotinile edilmiş ikincil antikor ile inkübe edin, ardından oda sıcaklığında streptavidin-HRP kompleksi ile inkübe edin.
- Açık veya koyu kahverengi bir renk geliştirmek ve immünoreaktif hücreleri görselleştirmek için bölümleri 3,3'-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi ile inkübe edin.
- Bölümleri hematoksilen ve% 0.3 (h / h) seyreltilmiş amonyak ile boyayın. Mikroskop altında 10X büyütme ile parlak alan görüntüleri çekin.
- 2 maske ayarlayarak hem epitel hem de lamina propria'daki (epitelin altındaki) işaretli bağışıklık hücrelerinin popülasyonunu tanımlamak ve ölçmek için bir görüntü işleme programı kullanın: bir renk algılama eşiği ayarlamak ve renkli DAB-reaktif alanları ölçmek için renk küpü tabanlı özellikteki ilk maskeyi kullanın; incelenen bölümdeki epitel ve laminer propria'nın toplam alanlarını belirlemek için ikinci maskeyi kullanın. İmmünoreaktif hücre popülasyonunu, sızan hücrelerin boyama alanının incelenen dokunun toplam alanına bir oranı olarak ifade edin.
