Tütün Ürünü Preparatlarına Maruz Kalan Periferik Kan Mononükleer Hücreleri Tarafından K562 Hücrelerinin Öldürülmesi

Özet

Kaynak: Arimilli, S. ve ark., Yanıcı Tütün Ürünü Preparatlarının Sitotoksisitesini ve İmmünosupresyonunu Değerlendirme Yöntemleri. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, yanıcı bir tütün ürünü hazırlığı olan tamamen dumanla şartlandırılmış bir ortamın, efektör periferik kan mononükleer hücreleri tarafından K562 hücresinin öldürülmesi üzerindeki etkisini inceliyoruz.

Protokol

1. K562 Öldürme Testi

NOT: K562 hücreleri, testten önce %80 birleşmeye ulaşana kadar RPMI tam ortamı ile 37 °C ve %5_CO2'de kültürde büyütülmelidir.

1. Şişeye 18 μl DMSO ekleyerek 5 mM karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) stok çözeltisi hazırlayın.
2. WS-CM veya nikotini, her kuyucuk için istenen eş nikotin birimlerini veya nikotin konsantrasyonlarını elde etmek için RPMI tam ortamı kullanarak toplam 100 μl/kuyu hacmine kadar 96 oyuklu bir plakada seyreltin.
   Dikkat: Nikotin akut toksiktir ve çevresel olarak tehlikelidir.
3. 1.5 x 10⁶ hücre / kuyu konsantrasyonunda RPMI tam ortamına 100 μl PBMC ekleyin. WS-CM veya nikotinli hücrelerin toplam hacmi 200 μl/kuyu olacaktır.
4. Plakayı örtün ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de 3 saat inkübe edin.
5. K562 hücrelerini 10 ml DPBS ekleyerek yıkayın ve RT'de 8 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
6. Hücreleri 10 ml DPBS ile yeniden süspanse edin ve K562 hücrelerini sayın.
7. 1 ml DPBS'ye 1 μl CFSE stok çözeltisi ekleyerek bir CFSE çalışma çözeltisi hazırlayın.
8. 1 - 2 x 10⁷ hücre içeren 1 ml K562 hücre süspansiyonuna 1 ml CFSE çalışma solüsyonu ekleyin. Girdap yapın ve RT'de tam olarak 2 dakika inkübe edin.
9. Hemen 200 μl FBS ekleyin. Girdap yapın ve RT'de tam olarak 2 dakika inkübe edin.
10. 10 ml RPMI tam ortam ekleyin ve tüpü RT'de 8 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
11. RPMI süpernatantını çıkarın ve peleti kırın ve hücreleri 10 ml RPMI tam ortamı ile yeniden süspanse edin ve CFSE etiketli K562 hücrelerini sayın.
12. PBMC'leri, plakayı RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyerek yıkayın. Sıvıyı boşaltarak süpernatanı aspire edin. Kapağı değiştirin ve plakanın altını girdaplayın. 200 μl RPMI tam ortam ekleyin ve yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
13. PBMC plakasının her bir numune kuyucuğuna 1:15 (100.000 K562: 1.5 x 10⁶ PBMC) oranında CFSE etiketli K562 hücreleri ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de 5 saat daha inkübe edin.
14. Hücre karışımını RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyerek yıkayın. Sıvıyı atarak süpernatanı aspire edin. Kapağı yerleştirin ve plakanın altını girdaplayın.
15. 200 μl çalışma tamponu ekleyin ve 14. adımda açıklanan yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
16. Toplam 100 μl / kuyucuk hacmi için her bir oyuğa 95 μl çalışma tamponu ve ardından 5 μl 7AAD ekleyin. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika inkübe edin.
17. Her bir oyuğa 100 μl çalışan tampon ekleyin ve plakanın her bir oyuğundan tüm hücre süspansiyonu hacmini küme tüplerine aktarın ve akış sitometresindeki numuneleri alın.
18. Akış sitometrisi analiz yazılımını kullanarak 7AAD pozitif ve CFSE pozitif hücrelerin yüzdesini belirleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12 X 75 tüp	BD Şahin	352058
15 ml konik tüpler	Corning	430790
2 mL Mikrotüpler	Aksiyen	MCT-150-C-S
50 ml konik tüpler	Corning	430828
500 ml şişe	Corning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
96 oyuklu düz tabanlı plaka	Termo Nunc	439454
96 oyuklu yuvarlak alt plakalar	BD Şahin	353077
Hücre kültürü başlığı	Termo Bilimsel	1300 Serisi A2
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	58110R
CFSE (Mali İşler T	Moleküler Problar Yaşam Teknolojileri	C34554
Küme tüpleri	Corning	4401	Yutulması halinde zararlıdır, kanserojendir
DMSO (Dimetil sülfoksit)	Sigma-Aldrich	D8418
DPBS (DPBS)	Fransa	17-512F
FBS (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442
Filtre ünitesi	Nalgene Belediyesi	156-4020
Akış Sitometresi	BD Biyolojik Bilimler	FACS Kanto II	Ex 405 nm ve Em785 nm'de 8 renk.
Akış Sitometresi	BD Biyolojik Bilimler	FACS Calibur	Ex 495 nm ve Em 785 nm'de 4 renk.
Akış sitometrisi analiz yazılımı	Ağaç Yıldızı	Akış Jo
nikotin	Sigma-Aldrich	N3876	Akut toksisite, Çevresel tehlike
Parafilm Filmi	Bemis	"M"
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148 Serisi	Yanıcı, Cilt tahrişi
Kalem/strep	Gibco Yaşam Teknolojileri	15140-122
dev/dak 1640	Gibco Yaşam Teknolojileri	11875-093
Çalışan arabellek	MACS Çalışan Tampon, Miltenyi Biotech	130-091-221
Transfer pipeti	Balıkçı Bilimsel	13-711-20
Tris Tabanı	Sigma-Aldrich	T1503

Serisi Serisi Adet Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi