>1. Sentetik kistik fibroz ortamı (SCFM2) hazırlayın
>NOT: SCFM2'nin hazırlanması aşağıda özetlenen üç ana aşamadan oluşur (Şekil 1).
- Domuz müsininin sterilizasyonu
- SCFM2'de 5 mg / mL'lik bir son konsantrasyonda steril müsin hazırlayın. Örneğin, 5 mL'lik bir SCFM2 hacmi için, steril bir Petri kabında 25 mg Tip II müsin tartın ve her saat hafifçe çalkalayarak 4 saat boyunca bir ultraviyole (UV) sterilizatöre koyun.
- 4 saat sonra, UV ile muamele edilmiş müsini steril koşullar altında otoklavlanmış 1,7 mL'lik tüplere aktarın ve -20 ° C'de saklayın.
- Tam sterilizasyonu doğrulamak için, bir müsin örneğini su veya Luria-Bertani (LB) suyu gibi steril bir sıvıda çözün ve mikroskop altında gözlemleyin.
not: Sterilize müsin -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
- Tamponlu tabanın hazırlanması
- Tablo 1'de listelendiği gibi deiyonize suya ağırlıkça uygun miktarlarda ekleyerek tuz ve amino asit stok çözeltileri hazırlayın. Tüm stok çözeltilerini 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak filtreyle sterilize edin, ışık bozulmasını önlemek için folyoya sarın ve bir aya kadar 4 °C'de saklayın.
- 190 mL deiyonize suyu Tablo 1'de listelenen hacimlere göre amino asit ve tuz suyu çözeltileri ile birleştirerek tamponlu bazı hazırlayın. Çözeltiyi pH 6.8'e ayarlayın ve 250 mL'lik bir nihai hacme yükseltin. 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de 30 güne kadar saklayın.
- Deneyden önceki akşam, istenen miktarda tamponlanmış bazı bir cam kültür şişesine alın ve müsin (adım 1.1.1'de tarif edildiği gibi 5 mg / mL) ve saflaştırılmış somon sperm DNA'sı (0.6 mg / mL) ekleyin. Nazikçe çalkalayın, folyoya sarın ve müsin ve DNA'nın çözelti içinde çözünmesini sağlamak için gece boyunca 4 °C'de bırakın.
not: Somon sperm DNA alikotları buz üzerinde çözülür, girdaplanmalı ve tamponlu baz ve müsine eklenmelidir. Triptofan, asparagin ve tirozin stok çözeltileri, deiyonize su yerine NaOH çözeltilerinde (konsantrasyonlar için Tablo 1'e bakınız) hazırlanmalıdır. Işığa maruz kalmaktan korumak için tamponlu tabanı ve tüm stok çözeltilerini folyoya sarılı tutun. Çoğu hisse senedi bir aya kadar sabit kalacaktır. Rengi solan stoklar kullanılmamalı ve kullanılmadan önce değiştirilmelidir.
- Ek stokların eklenmesi
- Deney günü, Tablo 2'de listelenen stokları müsin ve DNA içeren tamponlu baza ekleyin.
not: Deney günü taze birFeS04 çözeltisi hazırlayın, ancak diğer tüm stoklar önceden yapılabilir ve 4 ° C'de 30 gün boyunca saklanabilir. 1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) kloroform içerir. Dikkatli tutun ve açık alevlerin yakınında kullanmayın. DOPC ilavesinden sonra, SCFM2'yi 37 ° C'de çalkalayarak (250 rpm) en az 20 dakika (5 mL kültür için) inkübe edin. Bu inkübasyon süresi, DOPC'deki kloroformun buharlaşmasına izin verir. Şişe hava geçirmez olmamalıdır; bunun yerine, şişe açıklığını folyo ile gevşek bir şekilde kapatın.
2. Bakteri agregalarında antimikrobiyal toleransın gerçek zamanlı değerlendirmesi
- Gece kültürleri hazırlayın
- Deneyden önceki akşam, 5 mL LB suyunu antibiyotik (karbenisilin 300 μg/mL) içeren bir LB agar plakasından birkaç Pa PAO1-pMRP9-113 kolonisi ile aşılayın. 250 rpm'de çalkalama ile 37 °C'de gece boyunca büyütün.
not: Gerekli plazmitlerin seçimi için gerekli antibiyotiklerin eklenmesiyle gece boyunca kültürleri büyütün (burada, yeşil floresan protein (GFP) ekspresyon plazmidi, pMRP9-1). SCFM2 aşılanmadan önce Pa hücrelerinin yıkanması gerektiğini unutmayın. LB, gece kültürleri için diğer zengin laboratuvar ortamlarının yerine kullanılabilir. Tüm bakteri izolatları, bu protokol boyunca uygun BSL-2 yönergeleri kullanılarak ele alınmalıdır.
- SCFM2'yi aşılayın
- Deney gününde, 500 μL'yi 5 mL taze LB et suyuna aşılayarak Pa 1: 10 (kültür: sıvı ortam) kültürlerini gece boyunca geri seyreltin. 250 rpm'de çalkalama ile 37 ° C'de log fazına (60-90 dakika) kadar hücreleri büyütün.
- Log faz kültürlerini 10.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Hücreleri, süpernatanı çıkararak ve 3 mL filtreyle sterilize edilmiş fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.0) içinde yeniden süspanse ederek yıkayın. İki kez tekrarlayın ve peleti 1 mL PBS'lik son hacimde yeniden süspanse edin.
- 600 nm'de (OD600) bir spektrofotometre kullanarak yıkanmış hücrelerin absorbansını ölçün ve 5 mL SCFM2'de 0.05'lik bir başlangıç OD600'ü için gereken kültür hacmini hesaplayın. Pa'yı SCFM2'ye aşılayın ve hücreleri dağıtmak için nazikçe girdap yapın. Aşılanmış SCFM2'den 1 mL'yi 4 oyuklu, cam tabanlı, optik bir tabağın her bir haznesine pipetleyin ve 37 ° C'de statik olarak 4 saat inkübe edin.
not: Pa kültürlerinin iki katına çıkma süresi, suşa ve oksijenin mevcudiyetine bağlıdır. SCFM2'de, burada açıklanan koşullar altında, Pa'nın iki katına çıkma süresi ~1.4 saattir.
3. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile antibiyotik tedavisi sırasında agregaların görüntülenmesi
>NOT: Bu bölüm, SCFM2'de Pa agregalarının görüntülenmesi için konfokal lazer tarama mikroskobu ve görüntü yakalama yazılımının kullanımını açıklar. Amaç, antibiyotiklerle tedaviden sonra kalan (toleranslı) bakteriyel biyokütleyi gözlemlemek ve karakterize etmektir. Belirtilen adımlar diğer konfokal mikroskoplarda başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir, ancak özel rehberlik için cihaz kullanım kılavuzuna başvurulmalıdır.
- 37 ° C'lik bir ortam sıcaklığını korumak için ısıtılmış bir oda veya mikroskop aşamasına takılan ısıtılmış bir mikro plaka kullanarak görüntü Pa kültürleri. Tüm aparatların istenen sıcaklığa ulaşmasını sağlamak ve veri toplama sırasında daha fazla genleşme ve hareketi azaltmak için deneyin başlamasından en az 2 saat önce İnkübasyon modülünü başlatın.
- 4 saat sonra, Pa hücreleri içeren SCFM2 kültürlerini ısıtılmış mikroskop aşamasına aktarın. 4 kuyucuktan 3'ünü antibiyotik tedavisi için teknik kopyalar olarak belirleyin ve 4. kuyuyu antibiyotiksiz SCFM2'de sadece Pa hücreleri içeren, tedavi edilmeyen bir kontrol olarak düşünün. Floresan raportörlerin herhangi bir uyarılmasından önce Bul sekmesindeki parlak alan mikroskobunu kullanarak agregaları tanımlayın. Her kuyucuk içinde görüntüleme için bir alan tanımlayın ve görüntüleme yazılımındaki Pozisyonlar modülünü kullanarak konumunu (x-y-z koordinatları) kaydedin.
- SCFM2'de GFP ekspresyonu pMRP9-1'i içeren Pa kültürlerini 488 nm uyarma dalga boyu ve 509 nm emisyon dalga boyu ile görselleştirmek için 63x yağa daldırma hedefi kullanın. Toplama modülündeki z-stack seçeneğini kullanarak 1 μm aralıklarla (toplam 60 dilim) görüntü çekin. 60 μm z yığını görüntülerinin (1.093,5 mm3) toplam hacmi dahilinde GFP kanalındaki arka plan floresansını azaltmak için Çizgi ortalaması modülünü kullanın. Görüntü analizi için arka plan floresansını belirlemek için aynı ayarları kullanarak aşılanmamış SCFM2'nin kontrol görüntülerini alın.
not: Görüntüler, lamel tabanından 60 μm uzaklıkta olan 512 piksel x 512 piksel (0,26 μm x 0,26 μm piksel) 8 bit z-yığını görüntüleri üretilerek elde edilir.
- 18 saatlik bir süre boyunca 15 dakikalık aralıklarla her konumda (kuyu) 60 dilim yakalamak için görüntüleme yazılımı içindeki zaman serisi seçeneğini kullanın. Her konum için bir odak düzlemi depolamak için yazılım içindeki kesin odak stratejisini kullanın, bu düzlem deney boyunca her zaman noktasında geri döndürülür.
- Toplam 4,5 saatlik bir inkübasyondan sonra, antibiyotik ilavesinden önce dört kuyucuğun her birindeki toplam biyokütleyi belirlemek için yukarıdaki ayarları kullanarak her bir pozisyonu görüntüleyin.
- 6 saatlik toplam inkübasyondan sonra, her kopyaya minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) 2x altında antibiyotik ekleyin. Doğrudan ve nazikçe kuyunun ortasına, hava-sıvı interfazının hemen altına pipetleyin. Tüm kültürleri ısıtılmış konfokal odada tutun.
not: Burada 140 μg/mL konsantrasyonda kolistin sülfat kullanılmıştır.
- Görüntüleme programı içindeki Deneyi Başlat seçeneğine tıklayarak antibiyotik tedavisi sonrası görüntülemeye başlayın.
not: Kullanılan antibiyotik konsantrasyonu, antibiyotiğe, Pa izolatına ve kullanıcının öldürme veya tolerans etkilerini incelemek isteyip istemediğine bağlıdır. Bu deney tek bir doz kullanır. Gerekirse kültürleri bozmadan ek dozlar eklenebilir.
4. Pa agregalarının propidyum iyodür boyaması
NOT: Propidium iyodür (PI), kültürdeki canlı olmayan (ölü) bakteri hücrelerini tanımlamak için yaygın olarak bir boyama reaktifi olarak kullanılır. Burada, bölüm 3'te uygulanan antibiyotik tedavisine duyarlı agregaları tanımlamak için kullanılır. Bu protokol boyunca, Pa hücrelerinde GFP'nin ekspresyonu ve tespiti, hücre canlılığı için ana vekil olarak kullanılır. Bu son adım, canlı/ölü agregaların birbirleriyle ilişkili olarak uzamsal konumlarını belirlemek için konfokal görüntülemenin bir kez daha kullanılmasına izin verir. Ek olarak, agregalar, bölüm 3'te daha fazla aşağı akış hücre sıralaması için canlı/ölü olarak tanımlanır.
- 18 saat sonra, SCFM2 kültürleri içeren dört odacıklı optik alt tabağın her bir oyuğuna PI ekleyin. PI hacmi ve inkübasyon süresi için üreticinin talimatlarına uyun (ör., mL kültür başına ~ 2 μL, ~ 20-30 dakika).
5. Floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) yaklaşımı kullanarak canlı hücreleri agregalardan izole etme
NOT: FACS, floresan etiketli bir fenotipe göre hücre gruplarını sıralamak ve izole etmek için güçlü bir platform sunar. Burada FACS, canlı (antibiyotiğe toleranslı) agregaları canlı olmayan agregalardan izole etmek için kullanılır.
- Probidyum iyodür ile boyandıktan sonra, kültürleri inkübasyondan çıkarın ve 37 ° C'yi korumak için yalıtımlı bir kapta bir FACS cihazına aktarın.
- Pa agregaları içeren SCFM2'nin 1 mL'lik kısımlarını en düşük akış hızında çalıştırın.
not: Her alikot ~ 15.000 agrega içerecektir.
- GFP'yi tespit etmek için hücreleri 488 nm lazerle aydınlatın ve floresan sinyal yüksekliğini 530/30 nm'de kaydedin. PI boyamayı 561 nm lazerle uyararak görselleştirin ve floresan sinyal yüksekliğini 610/20 nm'de kaydedin. 70-u nozul kullanarak sıralama gerçekleştirin.
not: Sıralanan toplamalar, kullanıcının uygulamasına bağlı olarak birden çok şekilde havuza alınabilir. Bu durumda, aşağı akış RNA dizilimi için uygun Pa agregalarını sıralamak için FACS kullanıldı.
Tablo 1: Sentetik kistik fibrozis balgam besiyeri, SCFM2'nin tamponlu tabanı için gerekli tuz, amino asit, DNA ve müsin stoklarının hazırlanması.
| kimyasal | Stok Konsantrasyonu (M) | Nihai konsantrasyon (mM) | Notlar |
| NaH2PO4 | 0,2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0,2 | 1,25 | |
| KNO3 | 1 | 0,35 | |
| K2YANI4 | 0,25 | 0,27 | |
| NH4Cl | | 2,28 | Katıyı doğrudan tamponlu tabana ekleyin |
| Kartal | | 14,94 | Katıyı doğrudan tamponlu tabana ekleyin |
| NaCl (Doğal) | | 51,85 | Katıyı doğrudan tamponlu tabana ekleyin |
| Moplar | | 10 | Katıyı doğrudan tamponlu tabana ekleyin |
| Öğr | 0,1 | 1,45 | |
| Glu HCl | 0,1 | 1,55 | |
| lehinde | 0,1 | 1,66 | |
| Gly (Kızgın) | 0,1 | 1.2 | |
| Ala | 0,1 | 1,78 | |
| Val | 0,1 | 1,12 | |
| Tanış | 0,1 | 0,63 | |
| ıle | 0,1 | 1,12 | |
| Leu | 0,1 | 1,61 | |
| Orn HCl | 0,1 | 0,68 | |
| Lys HCl | 0,1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0,1 | 0,31 | |
| Trp | 0,1 | 0,01 | 0,2 M NaOH'de hazırlanmıştır |
| ASP | 0,1 | 0,83 | 0,5 M NaOH'de hazırlanmıştır |
| Tyr | 0,1 | 0,8 | 1.0 M NaOH'de hazırlanmıştır |
| Bu sayede | 0,1 | 1,07 | |
| Cys HCl | 0,1 | 0,16 | |
| fenilalanin | 0,1 | 0,53 | |
| Onun HCl H2O | 0,1 | 0,52 | |
| Somon Sperm DNA'sı | | 0.6 mg / mL | |
| Domuz Müsini | | 5 mg / nL | |
Tablo 2: Sentetik kistik fibrozis balgam besiyeri, SCFM2'nin tamponlu tabanı için gerekli ek stokların hazırlanması.
| kimyasal | Stok konsantrasyonu (M) | Nihai konsantrasyon (mM) | Notlar |
| Dekstroz (D-glu2cose) | 1 | 3 | |
| L-laktik asit | 1 | 9.3 | NaOH ile pH 7.0'a ayarlayın |
| CaCl2*H2O | 1 | 1,75 | |
| MgCl2 * 6H2O | 1 | 0,61 | |
| FeSO4 * 7H2O | 1 mg / mL | 0,0036 | Her gün taze yapın |
| N-asetilglukozamin | 0,25 | 0,3 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) | 25 mg / mL | 100 μg/mL | Eklendikten sonra 37 ° C'de en az 20 dakika inkübe edin |
