$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hücreleri Enfeksiyona Hazırlama
- 125 mL'lik bir şişe ve 37 ° C /% 5 CO2'de tutulan bir doku kültürü inkübatörü kullanılarak% 10 fetal buzağı serumu (bundan böyle DMEM / FCS olarak anılacaktır) ile desteklenmiş DMEM doku kültürü ortamında fare makrofaj benzeri hücre hattı RAW 264.7'yi çoğaltın.
- Enfeksiyondan bir gün önce, hücreleri genleşme şişesinden çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve 15 mL'lik vidalı kapaklı konik bir tüpte toplayın. Hücreleri 10 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı boşaltın, hücre peletini 1 mL DMEM / FCS'de (antibiyotiksiz) askıya alın ve bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak titreyi belirleyin.
- Titreyi 2 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın ve 48 oyuklu bir doku kültürü kabının kuyucuklarına 0.10 mL (2 x 105 hücre) ekleyin. Hücre süspansiyonunun kuyunun tüm yüzeyini kapladığından emin olun.
- Daha sonraki bir şartlandırılmış ortam kaynağı için ek kuyucuklardaki plaka hücreleri. Ayrıca, 'hücre kontrolü' olarak hizmet etmek için üç ek kuyucuğa 0.10 mL DMEM / FCS yerleştirin.
- Gece boyunca 37 °C /% 5 CO2'de bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ertesi gün, bakteri inokülumu hazırlanana ve kullanıma hazır olana kadar inkübatörden çıkarmayın.
2. Listeria monocytogenes'in (Lm) enfeksiyona hazırlanması
- 2 mL beyin-kalp infüzyonunu (BHI) taze çizgili bir agar plakasından (<2 gün) Lm ile tek bir koloni ile aşılayın ve gece boyunca 37 ° C'de 130 devir / dk'da çalkalayarak inkübe edin.
- Ertesi gün, 2 mL önceden ısıtılmış BHI'ye 0.10 mL gece kültürü ekleyin ve optik yoğunluk (OD600) 0.4 ile 0.6 arasında olana kadar çalkalayarak 37 ° C'de inkübe etmeye devam edin.
- Ampirik olarak türetilmiş bir dönüşüm formülü kullanarak yaklaşık bakteri titresini belirleyin. Laboratuvarımızda, BHI'de katlanarak büyüyen bir Lm kültürü yaklaşık 1.3 x 109 koloni oluşturan birim (CFU)/OD600'dür. Bakteri kültürlerinin oda sıcaklığına maruz kaldığı süreyi en aza indirin.
- Enfeksiyondan hemen önce, seyreltici olarak önceden ısıtılmış DMEM/FCS kullanarak titreyi 5 x 107 CFU/mL'ye ayarlayın.
3. Enfeksiyon
- Hızlı ve hassas bir şekilde çalışarak, 20 μL (1 x 106 CFU; enfeksiyon çokluğu, MOI = 5) taze hazırlanmış Lm aşısından (yukarıdaki adım 2.4) tabağı hafifçe eğerek ve pipet ucunu dikkatlice üstteki ortama yerleştirerek kuyucuklara ekleyin;
NOT: Pipet ucuyla kuyunun duvarlarına dokunmaktan kaçının.
- Tam karışımı sağlamak için her bir oyuğun içeriğini nazikçe pipetleyin; plakayı sallamayın veya önemli ölçüde eğmeyin, çünkü bu, Lm'yi kuyu duvarlarına yayacaktır. Hücre kültürü kabını 37 °C/%5 CO2 inkübatöre geri koyun.
- Seyreltici olarak enfekte olmamış kuyulardan şartlandırılmış ortam kullanarak 10 μg / mL'lik bir gentamisin çözeltisi hazırlayın.
- Enfeksiyondan 30 dakika sonra (mpi), dikkatlice 30 μL gentamisin çözeltisi (nihai konsantrasyon 2.5 μg / mL) ekleyin ve kuyu içeriğini daha önce olduğu gibi nazikçe pipetleyin ve hücre kültürü kabını 37 °C /% 5 CO2 inkübatöre geri koyun.
- 60 mpi'de, CFU tahlili (60 mpi zaman noktası) veya FCM analizi (sırasıyla aşağıda bölüm 4 ve 5'te açıklandığı gibi) için uygun kuyuları hasat edin.
- Kalan oyuklar için, daha sonra çeşitli zamanlarda ya daha önce olduğu gibi hücreleri hasat edin ya da Lm çıkış tahlili için, ortamı kuyudan tamamen çıkarın ve 150 μL gentamisin içermeyen şartlandırılmış ortam ile değiştirin.
>4. CFU Testi ile Hücre İçi ve Acil Lm'nin Numune Alınması, İşlenmesi ve Analizi
- Hasat etmek için, tabağı hafifçe eğin ve tüm ortamı kuyudan dikkatlice çıkarın. Kuyuya 0.50 mL damıtılmış steril su (dsH2O) ekleyin. 30 saniye sonra, elde edilen su lizatını (100) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın.
- 450 μL ds2O'ya 4.5 μL veya 50 μL su lizatı ekleyerek 10-1 ve 10-2 seyreltme hazırlayın ve iyice karıştırmayı sağlamak için kısaca girdap yapın.
- 100, 10-1 ve/veya 10-2 numunenin 50 μL'sini lizojeni et suyu (LB) agar plakalarına yayın.
- Ortaya çıkan Lm'yi test etmek için (yukarıdaki adım 3.6), üst üste binen ortamın 10 μL'sini çıkarın ve iki 5 μL'lik alikota bölün: bir alikota 5 μL DMEM/FCS ekleyin ve ikinci alikota 5 μg/mL gentamisin içeren 5 μL DMEM/FCS ekleyin. İkinci kontrol, sonraki CFU testinde hücre dışı Lm (gentamisine duyarlı) ve hücre içi Lm (gentamisine dirençli) arasında ayrım yapar.
- Oda sıcaklığında 5 dakika sonra, 90 μL dsH2O ekleyin, 10 saniye kuvvetlice girdap yapın ve LB agar plakalarına 50 μL yayın.
- 37 ° C'de 2 günlük inkübasyonun ardından LB agar plakaları üzerindeki Lm kolonilerini sayın.