İntrasellüler ve Acil Ekstraselüler Listeria monocytogenes'in In Vitro Flow Sitometri Analizi

Özet

Kaynak: Gayle, P. et al., Hücresel ve Organizma Düzeyinde Konak Yanıtlarını Araştırmak için Bakteriyel Bir Patojen Kullanma. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, hücre içi patojenik bir bakteri olan hücre içi ve hücre dışı Listeria monocytogenes'i, kültür makrofajlarının in vitro olarak enfeksiyonunu takiben akış sitometrisi kullanarak ölçüyoruz.

Protokol

>1. Akış Sitometrisi (FCM) ile Hücre İçi ve Acil Lm'nin Örneklenmesi, İşlenmesi ve Analizi

1. 125 mL'lik bir şişe ve 37 ° C /% 5 CO_2'de tutulan bir doku kültürü inkübatörü kullanarak% 10 fetal buzağı serumu (bundan böyle DMEM / FCS olarak anılacaktır) ile desteklenmiş DMEM doku kültürü ortamında fare makrofaj benzeri hücre hattı RAW 264.7'yi hazırlayın. Hücreleri 1 x 10⁶ hücre / mL'ye ayarlayın ve 6 oyuklu bir doku kültürü kabının kuyucuklarına 1 mL (1 x 10⁶ hücre) ekleyin.
2. Listeria monocytogenes, Lm, bakteri inoculum'u hazırlayın ve 50'lik bir MOI'ye (5 x 10⁷ CFU) karşılık gelen inokülum hacmine sahip hücreleri enfekte edin.
3. Enfeksiyondan 1,5 saat sonra (hpi), ilk kuyucuk setinden ortam toplayın ve 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve tüm kuyucuklar işlenene kadar buzun üzerine yerleştirin.
4. Hücre içi Lm'yi toplamak için, kuyuya 1 mL ds H₂O ekleyin ve 60 saniye sonra, elde edilen su lizatını 500 μL% 4 PFA ile 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 10 saniye kuvvetlice girdap yapın ve tüm kuyucuklar işlenene kadar buzun üzerine koyun.
5. Kalan kuyucuklar için, ortamı çıkarın ve hücre dışı Lm'yi öldürmek ve hücreleri derhal inkübatöre geri döndürmek için 5 μg / mL gentamisin ile 1 mL DMEM / FCS ile değiştirin.
6. 30 dakika (2 hpi) sonra ortamı çıkarın ve gentamisin içermeyen DMEM / FCS ile değiştirin.
7. 2 ve 4 saat sonra (4 ve 6 hpi) medya ve lizat toplayarak ikinci ve üçüncü zaman noktalarını alın.
8. Tüpleri 7 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın.
9. Her peleti 50 μL% 4 PFA ve 15 μL falloidin içeren bir boyama kokteyli içinde süspanse edin. Tüpleri karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
10. İnkübasyondan sonra, her tüpe 1 mL FACS tamponu ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
11. Tüpleri 7 dakika boyunca 10.000 x g'da döndürün. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın.
12. Her peleti hemen kullanım için 400 μL FACS tamponunda veya daha sonra analiz için saklıyorsanız 200 μL FACS tamponunda ve 200 μL %4 PFA'da askıya alın.
13. Örnekleri akış sitometrisi üzerinde çalıştırın ve toplanan verileri analiz edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BHI (Beyin Kalp İnfüzyonu) suyu	EMD Milipore	110493
Hücre Süzgeci, 70 μm	VWR (VWR)	10199-656
Kollajenaz D	Roche	11088858001
DMEM ortamı	Gibco (Gibco)	11965-092
FACS tüpleri	BD Şahin	352054
FBS - Isı Etkisiz Hale Getirilmiş	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisi	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB agar	Büyüyen Hücreler MS	MBPE-4040
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Sarı Ölü Hücre Lekesi kiti	Yaşam Teknolojileri	L349S9
Rodamin Phalloidin	Termo Fischer	R415
SP6800 Spektral Analiz Cihazı	Sony
TPP Doku Kültürü 48 Kuyucuklu Plakalar	MIDSCI (ORTA BILIM)	TP92048
TPP Doku Kültürü 6 Kuyucuklu Plakalar	MIDSCI (ORTA BILIM)	TP92406

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi