>1. Sinekleri toplayın ve hazırlayın
- İstenilen deneysel koşullar altında arka Drosophila melanogaster. Yetiştirme sırasında sinekleri aşırı kalabalıklaştırmamaya dikkat edin ve larva yoğunluğunun tedaviler arasında tutarlı olduğundan emin olun, çünkü larva aşamasındaki çevresel koşullar yetişkin aşamasında bağışıklık savunma fenotiplerini derinden etkileyebilir.
- Pupa vakasından eklosiyondan 0 - 3 gün sonra deneysel sinekleri toplayın ve taze ortama aktarın.
- Toplanan sinekleri, eklosiyondan 5 - 7 gün sonra yaşlanana kadar istenen bir sıcaklıkta (genellikle 22 °C ile 28 °C arasındaki sıcaklıklar uygundur) barındırın.
not: Bu, sineklerin metamorfozu tamamlaması ve olgun yetişkinler haline gelmesi için yeterli zaman sağlar, ancak yaşlanma başlamadan çok öncedir.
- Enfeksiyondan önce istenen sayıda sineği ayrı bir şişeye ayırın ve yine aşırı kalabalıktan kaçınmaya dikkat edin.
not: Bu gösteride sadece erkekler enfekte olur, ancak açıklanan prosedürü kullanarak kadınları enfekte etmek de aynı derecede mümkündür.
2. Bakterileri Kültür Yapın ve Hazırlayın
- Enfeksiyondan en az 2 gün önce seçilen bakterilerin bir ana plakasını hazırlayın. Bakterileri -80 °C'de süresiz olarak saklanan %15'lik bir gliserol stoğundan çıkarın. Ana plakayı 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın. Ana plakaları her zaman doğrudan donmuş gliserol stoğundan çizin. Bakterilerin plakadan plakaya seri geçişinden kaçının, çünkü kültürde tekrarlanan geçiş bakterilerin zayıflatılmış virülans geliştirmesine neden olabilir.
not: Bu örnekte Providencia rettgeri ve Escherichia coli kullanılmıştır.
- Enjeksiyon için bakteriyel bir süspansiyon hazırlamak için aşağıdaki prosedürü kullanın.
- Ana plakadan izole edilmiş tek bir koloni ile steril bir ortamı aşılayarak 2 ml'lik bir bakteri kültürü büyütün. Bakterileri durağan faza kadar büyütün (örneğin, 37 ° C'de O/N büyümesi).
not: Hem P. rettgeri hem de E. coli, Luria Broth'ta 20 - 37 ° C arasındaki sıcaklıklarda hafif çalkalama ile iyi büyür.
- Kültür durağan faza ulaştığında, bir masa üstü santrifüjde (5.000 x g'da 3 dakika) kültürün yaklaşık 600 μl'sinden hücreleri nazikçe peletleyin, süpernatanı atın ve bakterileri yaklaşık 1.000 μl steril fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM Sodyum klorür, NaCl, 2.7 mM potasyum klorür, KCl, 10 mM sodyum fosfat, Na2PO4, 1.8 mM potasyum dihidrojen fosfat, KH2PO4, pH = 7.4).
- 600 nm'de absorbans olarak bir spektrofotometre ile ölçülen, kullanılan bakteri için uygun bir optik yoğunluk (OD) elde etmek için yeniden süspanse edilmiş hücreleri steril PBS'de seyreltin. Sinekleri enfekte etmek için bu süspansiyonu kullanın.
not: A:600 = 0.1 veya 1.0, sırasıyla yaklaşık 10,8 ve 10,9, Providencia, rettgeri veya E. coli'ye karşılık gelir. Hem canlı hem de ölü bakteriler optik yoğunluğa katkıda bulunduğundan, bakteri cesetleri birikmeden ve optik yoğunluk ile enfeksiyon sırasında ortaya çıkan canlı bakteri sayısı arasındaki ilişkiyi bozmadan önce kültürlerin durağan fazda erken hasat edilmesi önemlidir.
3. Sinekleri Enfekte Edin
NOT: Drosophila bağışıklığı sirkadiyen ritimden etkilendiğinden, deneysel kopyalar arasında enfeksiyonları günün benzer bir saatinde gerçekleştirmek önemlidir.
- Nanoenjektör Kullanma
- Cam iğneleri enfeksiyona karşı hazırlayın.
- Bir mikropipet çektirme kullanarak bir borosilikat cam kılcal damarı çekerek bir cam iğne hazırlayın.
- Forseps kullanarak, sıvının dışarı atılmasına izin vermek için yaklaşık 50 μm çapında bir açıklık oluşturmak için iğnenin ucunu kırın.
- Enjektörü monte edin.
- Sızdırmazlık O-ringini ve ardından beyaz ara parçayı (dışa bakan büyük çukur) metal pistonun üzerine yerleştirin.
- Cam iğneyi 30 G iğneli bir şırınga kullanarak mineral yağ ile doldurun.
- Doldurulmuş cam iğneyi pensin içinden geçirin ve ardından daha büyük O-ringi, iğnenin kör ucundan yaklaşık 1 mm uzakta olacak şekilde tabanının etrafına yerleştirin.
- İğneyi metal pistonun üzerine kaydırın ve sabitlenene kadar penseti hafifçe vidalayın.
- Mineral yağın çoğunu enjektörden çıkarın, ancak enjektör ile bakteri süspansiyonu arasında bir bariyer görevi görmesi için iğnede hala küçük bir hacimde yağ olduğundan emin olun. Mineral yağ veya bakteriyel süspansiyon içinde veya iki sıvı arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- Enjektörü enjeksiyon için istenen hacme ayarlayın (9 nl ile 50 nl arasında).
- Yaralama kontrolleri oluşturun.
- Kılcal iğnenin ucunu ortamın bir tüpüne dikkatlice sokarak ve enjektör üzerindeki "doldurma" düğmesine basarak enjektör iğnesini steril PBS ile doldurun.
not: Steril bakteri üreme ortamı, deney büyüme ortamlarında asılı kalan bakterilerin enjeksiyonunu gerektiriyorsa, yara kontrolü olarak da kullanılabilir. Bununla birlikte, bakteri üreme ortamı, bağışıklık sistemini uyarabilecek veya konakçı üzerinde başka etkilere sahip olabilecek bileşenler içerdiğinden, PBS gibi inert bir taşıyıcı tercih edilir.
- Hafif bir karbondioksit (CO2 ) akışı altında istenen sayıda sineği uyuşturun.
- Steril PBS ile ventrolateral yüzeydeki ön karın bölgesindeki sinekleri enjekte edin.
not: Toraksın sternoplevral plakası gibi diğer bölgelere sinek enjekte etmek de mümkündür, ancak enjeksiyon bölgesini her deneyde tutarlı tutmak önemlidir.
- Enjekte edilen sinekleri yeni bir ortamla taze şişelere yerleştirin, sineklerin yiyeceğe yapışmasını önlemek için tüm sinekler anesteziden kurtulana kadar şişeleri yan yatırın.
not: Deney sineklerine bakteri enjekte etmeden önce PBS kontrol sineklerinin enjekte edilmesi önerilir, böylece her iki tedavi için de aynı iğne kullanılabilir. Tüm bir deney için aynı iğneyi kullanmak her zaman mümkün olmayacaktır. Bu durumda, hangi iğnenin hangi sineklerle kullanıldığının kaydedilmesi ve iğne kimliğinin istatistiksel analize deneysel bir faktör olarak dahil edilmesi istenebilir.
- Bakteriyel patojeni enjekte edin.
- Kalan steril ortamı enjektörden çıkarın ve aynı iğneyi bakteri süspansiyonu ile yeniden doldurun.
- Yukarıdaki prosedürü (3.1.3) tekrarlayın, şimdi prosedür 2.2'de hazırlanan bakteri süspansiyonu ile sineklere enjekte edin.
