>1. Sinekleri toplayın ve hazırlayın
- İstenilen deneysel koşullar altında arka D. melanogaster. Yetiştirme sırasında sinekleri aşırı kalabalıklaştırmamaya dikkat edin ve larva yoğunluğunun tedaviler arasında tutarlı olduğundan emin olun, çünkü larva aşamasındaki çevresel koşullar yetişkin aşamasında bağışıklık savunma fenotiplerini derinden etkileyebilir.
- Pupa vakasından eklosiyondan 0 - 3 gün sonra deneysel sinekleri toplayın ve taze ortama aktarın.
- Toplanan sinekleri, eklosiyondan 5 - 7 gün sonra yaşlanana kadar istenen bir sıcaklıkta (genellikle 22 °C ile 28 °C arasındaki sıcaklıklar uygundur) barındırın.
not: Bu, sineklerin metamorfozu tamamlaması ve olgun yetişkinler haline gelmesi için yeterli zaman sağlar, ancak yaşlanma başlamadan çok öncedir.
- Enfeksiyondan önce istenen sayıda sineği ayrı bir şişeye ayırın ve yine aşırı kalabalıktan kaçınmaya dikkat edin.
not: Bu gösteride sadece erkekler enfekte olur, ancak açıklanan prosedürü kullanarak kadınları enfekte etmek de aynı derecede mümkündür.
2. Bakterileri Kültür Yapın ve Hazırlayın
- Enfeksiyondan en az 2 gün önce seçilen bakterinin bir ana plakasını hazırlayın. Bakterileri -80 °C'de süresiz olarak saklanan %15'lik bir gliserol stoğundan çıkarın. Ana plakayı 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın. Ana plakaları her zaman doğrudan donmuş gliserol stoğundan çizin. Bakterilerin plakadan plakaya seri geçişinden kaçının, çünkü kültürde tekrarlanan geçiş bakterilerin zayıflatılmış virülans geliştirmesine neden olabilir.
not: Bu örnekte Providencia rettgeri ve Escherichia coli kullanılmıştır.
- Enjeksiyon için bakteriyel bir süspansiyon hazırlamak için aşağıdaki prosedürü kullanın.
- Ana plakadan izole edilmiş tek bir koloni ile steril bir ortamı aşılayarak 2 ml'lik bir bakteri kültürü büyütün. Bakterileri durağan faza kadar büyütün (örneğin, 37 ° C'de O/N büyümesi).
not: Hem P. rettgeri hem de E. coli, Luria Broth'ta 20 - 37 ° C arasındaki sıcaklıklarda hafif çalkalama ile iyi büyür.
- Kültür durağan faza ulaştığında, bir masa üstü santrifüjde (5.000 x g'da 3 dakika) kültürün yaklaşık 600 μl'sinden hücreleri nazikçe peletleyin, süpernatanı atın ve bakterileri yaklaşık 1.000 μl steril fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1.8 mM KH2PO4, pH = 7.4).
- 600 nm'de absorbans olarak bir spektrofotometre ile ölçülen, kullanılan bakteri için uygun bir optik yoğunluk (OD) elde etmek için yeniden süspanse edilmiş hücreleri steril PBS'de seyreltin. Sinekleri enfekte etmek için bu süspansiyonu kullanın.
not: A600 = 0.1 veya 1.0, sırasıyla yaklaşık 10,8 ve 10,9, Providencia, rettgeri veya E. coli'ye karşılık gelir. Hem canlı hem de ölü bakteriler optik yoğunluğa katkıda bulunduğundan, bakteri cesetleri birikmeden ve optik yoğunluk ile enfeksiyon sırasında ortaya çıkan canlı bakteri sayısı arasındaki ilişkiyi bozmadan önce kültürlerin durağan fazda erken hasat edilmesi önemlidir.
3. Sinekleri Enfekte Edin
NOT: Drosophila bağışıklığı sirkadiyen ritimden etkilendiğinden, deneysel kopyalar arasında enfeksiyonları günün benzer bir saatinde gerçekleştirmek önemlidir.
- Septik iğne batması ile
- İğneyi iğneleme için hazırlayın.
- 200 μl'lik bir mikropipet ucunun ucunu eritin ve erimiş plastiğe 0,15 mm'lik bir böcek minutien pimi yerleştirin. Plastiğin, pimin yaklaşık 0,5 cm'si plastikten uzanacak şekilde pim yerinde tutulacak şekilde katılaşmasına izin verin.
- Yaralama kontrolleri oluşturun.
- Hafif bir CO2 akışı altında istenen sayıda sineği uyuşturun.
- Göğüs kafesinin sternoplevral plakasındaki sinekleri iğne ile delin, kanatların ve bacakların bağlantı yerlerinden kaçının. Gerekirse, yumuşak forseps kullanarak minutien pimindeki sinekleri nazikçe çıkarın.
not: Sinekleri ventrolateral yüzeydeki ön karın gibi diğer bölgelere delmek de mümkündür, ancak enjeksiyon bölgesini her deneyde tutarlı tutmak önemlidir. Karnın kütikülünden delinmek, göğüs kafesi delinmesinden daha zor olma eğilimindedir ve bu nedenle daha az yaygındır.
- Delinmiş sinekleri yeni bir sinek ortamı ile taze bir şişeye yerleştirin ve sineklerin yiyeceğe yapışmasını önlemek için tüm sinekler anesteziden kurtulana kadar şişeyi yan yatırın.
- Bakteriyel enfeksiyonu tanıtın.
- Hafif bir CO2 akışı altında istenen sayıda sineği uyuşturun.
- Her bir sineği medya kontrolleriyle aynı yere delin, her bir sineği delmeden önce pimin ucunu prosedür 2.2'de hazırlanan bakteri süspansiyonuna daldırın.
- Delinmiş sinekleri yeni bir sinek ortamı ile taze bir şişeye yerleştirin ve sineklerin yiyeceğe yapışmasını önlemek için tüm sinekler anesteziden kurtulana kadar şişeyi yan yatırın.