E. coli Enfeksiyonunu Takiben Drosophila melanogaster'de E. coli Bakteri Yükünün Ölçülmesi

Özet

Kaynak: Khalil, S., et al. Drosophila melanogaster'de Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve İmmün Savunma Fenotipleri. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, E. coli'yi Drosophila melanogaster'in göğüs kafesine enjekte ettikten sonra E. coli bakteri yükünü ölçmek için bir teknik gösteriyoruz.

Protokol

1. Enfeksiyon Sonrası Bakteri Yükünü Test Edin

1. Bakteri yükünü ölçün.
   1. Enjeksiyondan sonra öngörülen bir zamanda, her bir sineği buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
   2. Her tüpe 250 μl PBS ekleyin ve sinekleri bir havaneli veya boncuk çırpıcı kullanarak homojenize edin.
   3. Homojenatı, bir spiral plater veya seri bir seyreltme kullanarak bir LB agar plakası üzerine yerleştirin.
      1. Seri seyreltme kullanarak plakalamak için, her bir sinek homojenatını 96 oyuklu bir plakanın ilk sırasına aktarın.
      2. Kalan sıraların her birini 90 μl PBS ile doldurun.
      3. Çok kanallı bir pipet kullanarak, sinek homojenatı içeren ilk sıradan 10 μl alın ve ikinci sıraya dağıtın.
      4. İyice karıştırmak için en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından 10 μl alın ve üçüncü sıraya aktarın. Kalan satırları kullanarak bu işlemi yineleyin.
      5. En alt sıradan başlayarak (çoğu seyreltik bakteri süspansiyonu), her bir oyuktan 10 μl almak için çok kanallı pipeti kullanın ve numunelerin birbirine temas etmeyen ayrı noktalar olarak dağıtılmasına dikkat ederek bir LB plakasına koyun. Her sıradan tüm oyuklardan numune alınana kadar tekrarlayın ve bunları LB plakası üzerinde azalan seyreltme sırasına göre dağıtın.
      6. Lekeler LB plakasına tamamen ıslanana kadar plakayı RT'de bırakın.
         not: Sıvının kolayca emilmesini sağlamak için LB plakasını kullanmadan önce RT'de birkaç gün kurutmanız önerilir, bu da numune noktaları arasında kazara temas olasılığını en aza indirir.
   4. Kolonilerin küçük ve ayrık kalması için plakaları aşırı büyütmemeye dikkat ederek plakaları O / N inkübe edin.
      not: Kullanılan bakteri üreme ortamına ve kuluçka sıcaklığına bağlı olarak, sineğin endojen bağırsak mikrobiyotasından türetilen koloniler sonunda plaka üzerinde görünebilir. Bununla birlikte, patojenik enfeksiyon için kullanılan çoğu bakteri, 37 ° C'de LB agardaki bağırsak mikrobiyotasından çok daha hızlı büyür.
   5. Deneysel bakteriler görünür koloniler ürettiğinde (tipik olarak 8-12 saat), ancak Drosophila bağırsak mikrobiyota kolonileri ortaya çıkmadan önce (yaklaşık 36 saat) plakaları inkübatörden çıkarın. Yavaş büyüyen deneysel bakteriler için, bağırsak mikrobiyotasından herhangi bir koloniyi çıkarmak için LB agarda seçici bir antibiyotik kullanın.
   6. Her homojenat için koloni sayısını sayın.
      1. Spiral plakalar için, plaka üzerindeki kolonilerin sayısına ve konumuna bağlı olarak ml homojenat başına bakteri yükünü tahmin edebilen otomatik bir koloni sayacı kullanarak büyüyen kolonileri sayın.
         NOT: Spiral sayımları, bakteri konsantrasyonu ml başına 5 x 10² ila 5 x 10⁴ bakteri aralığında olduğunda en doğrudur.
      2. Spot plakalar için, 30 - 300 koloni içeren herhangi bir seyreltmeden her sinek için kolonileri manuel olarak sayın ve orijinal homojenatın ml'si başına bakteri sayısını hesaplayın.
2. Verileri analiz edin.
   1. Bakteri yükü normal değilse, normal bir dağılıma daha iyi yaklaşmak için verileri dönüştürün veya parametrik olmayan istatistiksel analiz (örneğin, Mann-Whitney U testi) kullanarak verileri analiz edin. En uygun dönüşümü bulmak için bir Box-Cox analizi kullanın; Doğal log veya base -10 log dönüşümleri genellikle etkilidir.
   2. Veriler yeterince normal dağılmışsa ve karşılaştırılan sadece iki tedavi varsa, iki tedavinin farklı ortalama bakteri yüklerine yol açıp açmadığını belirlemek için bir t-testi yapın. Birden fazla deneysel değişken veya diğer potansiyel olarak öngörücü faktörler varsa, hangi faktörlerin bakteri yükünün önemli belirleyicileri olduğunu belirlemek için Varyans Analizi'ni (ANOVA) kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Şeffaf Kapaklı Petri Kapları, Yükseltilmiş Sırt; 100 x 15 mm;	VWR uluslararası	25384-302
LB Ağar, Değirmenci	Difco Bilişim	244520
Aşılama Döngüsü	VWR uluslararası	80094-488
1.5 mL Mikrosantrifüj tüpleri; Mühür Ayini	ABD Bilimsel A.Ş.	1615-5500
Motorlu havaneli; Talboys Laboratuvar Karıştırıcı	Troemner ·	103
Talboys Yüksek Verimli Homojenizatör	OPS Teşhisi	930145
5/32'' Taşlama Bilyaları	OPS Teşhisi	GBSS 156-5000-01
Girdap Cini	Bilimsel endüstriler a.ş.	G560
Çok Kanallı Pipetleyici (10uL-300uL)	Sartorius	730360
WASP2 Whitley Otomatik Spiral Silindir	Mikrobiyoloji Uluslararası
ProtoCOL otomatik koloni sayacı / plaka sayacı / plaka okuyucu	Mikrobiyoloji Uluslararası
kuvöz	Güçler Bilimsel, Inc	DROS52SD