Kültürlenmiş Böcek Hücrelerinde Drosophila C Virüsünün Virüs Enfeksiyöz Dozunu Belirlemek İçin Test

Özet

Kaynak: Yang, S. et al., Drosophila melanogaster'de Viral Enfeksiyonun Kurulması ve Konak-Virüs Etkileşiminin Analizi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, Drosophila S2* hücreleri üzerinde Drosophila C virüsünün doku kültürü enfektif viral dozunu belirlemek için sitopatik etki testini gösteriyoruz. Kültürlenmiş hücreleri enfekte etmek için bir dizi viral konsantrasyon kullanılır. Yapısal değişiklikler sergileyen hücrelerin oranı belirlenir ve bu veriler doku kültürü enfektif dozunu hesaplamak için kullanılır.

Protokol

1. CPE testi ile Drosophila C virüsü yük ölçümü

1. Bir sitopatik etki (CPE) testi ile ortalama virüs doku kültürü enfektif dozunu (TCID₅₀) belirlemek için 5 rastgele virüs içeren tüp seçin (1 birim TCID₅₀ = 0.7 plak oluşturan birim [PFU]).
   not: CPE, viral invazyonun neden olduğu konak hücrelerindeki yapısal değişiklikleri ifade eder. Enfekte edici virüs, konak hücrenin parçalanmasına veya hücre çoğalamama nedeniyle lizis olmadan öldüğünde neden olur.
2. 1. günde, hazırlanan S2* hücrelerini pipetleme ile toplayın. Hücre numarasını sayın. Hücreleri 4 dakika boyunca 300 x g santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri, S2* hücreleri için tam bir ortamla 1 x^{10 6} hücre / mL yoğunluğa seyreltin.
3. Tohum: 1 x 10⁵ S2 * hücre (100 μL), düz tabanlı 96 oyuklu plakaya (~% 30 birleşme).
4. S2* hücreleri için tam ortamla DCV stoğunun seri 10 kat seyreltmelerini gerçekleştirin. Kuyuya 50 μL seyreltme ekleyin. Negatif kontrol kuyusu olarak sınıflandırılan kuyuya virüssüz 50 μL kültür ortamı ekleyin.
   not: Her seyreltme oranı için 8 kuyu kullanılmıştır. Tipik DCV verimi 10^{8-10 9} PFU/mL civarında olduğundan, seyreltme en az ~10^{−5-10−10'u} kapsamalıdır.
5. 4. günde, CPE'yi 20X veya 40X objektifli bir parlak alan mikroskobu ile gözlemleyin. Hücrelerin bulanık göründüğü ve ortamın parçalarla dolu olduğu bir kuyuyu "pozitif kuyu" ve hücre morfolojisinin normal olduğu bir kuyuyu "negatif kuyu" olarak sınıflandırın.
6. CPE pozitif veya negatif kuyucukları sırasıyla + veya – ile işaretleyin. TCID₅₀ virüsünü Reed ve Muench yöntemiyle hesaplayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 ml Mikrosantrifüj tüpleri	dağlamak	352070
10 cm hücre kültürü kabı	Sigma	CLS430167	Hücre kültürü
Hücre İnkübatörü	Fransa	MIR-553 Serisi
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5810R
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5424R
Drosophila Kuluçka Makinesi	Percival	I-41NL	Drosophila'nın yetiştirilmesi
FBS (FBS)	Canlandırıcı	12657-029	Hücre kültürü
Schneider'in Böcek Ortamı	Sigma	S9895 Serisi	Hücre kültürü
İstatistiksel yazılım	GraphPad Prizma 7
Düz tabanlı 96 kuyulu plaka	Sigma	CLS3922	Hücre kültürü
Hücre İnkübatörü	Fransa	MIR-553 Serisi
mikroskop	Olympus	CKX41

Serisi Belediyesi Serisi