Floresan mikroskobu ile inflamatuar aktivasyonun tespiti

Özet

Kaynak: den Hartigh, A. B. et al., Murin Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Aktivasyon ve Piroptotik Hücre Ölümünün Tespiti. J. Vis. Uzm.(2018)

Bu videoda, floresan raportör probları kullanılarak makrofajlarda NLRP3 inflamatuar aktivasyonunu tespit etmek için bir yöntem gösterilmektedir. Hücreler, inflamatuar montajını ve kaspaz-1 aktivasyonunu indüklemek için potasyum iyonoforlar ve glisin ile muamele edilir. Floresan raportör probları aktive edilmiş kaspaz-1'i görselleştirir ve hücreler, çekirdek görselleştirme için bir floresan boya ile boyanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kemik İliği Hasadı

1. Femur ve tibiayı bir fareden aseptik olarak çıkarın ve steril aletler kullanarak kemikleri temizleyin. Temizlenmiş kemikleri Dulbecco Modifiye Eagle Medium (DMEM) + 5 mM N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) + 0.2 mg/mL L-glutamin + 0.05 mM 2-merkaptoetanol + 50 mg/mL gentamisin sülfat + 10.000 U/mL penisilin/streptomisin +% 10 fetal sığır serumu (FBS, DMEM-10 tamamlandı) içine yerleştirin ve tüpü 15 dakika buz üzerinde inkübe ....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
E-MEM (İngilizce)	ATCC (Uzay Servisi)	30-2003	L929 hücrelerini büyütmek için
NCRC klonu 929 (L929)	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-1
Fiksasyon/Geçirgenlik Kiti	BD Biyolojik Bilimler	554714	Fiksasyon ve geçirgenleştirme çözeltisi ve yıkama tamponu içerir. Tescilli formülasyonlar. %4,2 formaldehit içerir
glisin	Biyorad	161-0718
FAM-YVAD-FMK	İmmünositokimya Teknolojileri	98
Dulbecco'nun PBS'si, kalsiyum yok, magnezyum yok	Canlandırıcı	14190144
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ABD menşeili	Canlandırıcı	26140079	55 ° C'de 50 dakika boyunca ısıyla etkisiz hale getirilir
Gentamisin	Canlandırıcı	15750060
ProLong Gold Montaj Ortamı	Canlandırıcı	P36934 Serisi	Tescilli formülasyon. Kürleme montaj ortamı. 1.46 refrakter indeksine kadar sertleşir
HEPES (Ultra Saf)	Canlandırıcı	11344041
L-Glutamin	Canlandırıcı	21051024
Penisilin-Streptomisin	Canlandırıcı	15140122
C57BL/6J fare	Jackson Laboratuvarı	664
Kaspaz-1/11-/- fare	Jackson Laboratuvarı	16621
Leica SP8X Konfokal Mikroskop	Leica Belediyesi
Salmonella minnesota R595'ten ultra saf LPS (Re)	Liste Biyolojikleri	434
Beta-merkapto-etanol	Millipore-Sigma	M6250-10ML
DMSO (Türkçe)	Millipore-Sigma	D2650-5X10ML
Edta	Millipore-Sigma	E5391

Serisi adet Serisi Serisi