Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kemik İliği Hasadı
- Femur ve tibiayı bir fareden aseptik olarak çıkarın ve steril aletler kullanarak kemikleri temizleyin. Temizlenmiş kemikleri Dulbecco Modifiye Eagle Medium (DMEM) + 5 mM N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) + 0.2 mg/mL L-glutamin + 0.05 mM 2-merkaptoetanol + 50 mg/mL gentamisin sülfat + 10.000 U/mL penisilin/streptomisin +% 10 fetal sığır serumu (FBS, DMEM-10 tamamlandı) içine yerleştirin ve tüpü 15 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Proksimal ve distal bilyeli mafsalları makas kullanarak çıkarın. Orta ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 25 G'lik bir iğneyi kemiklerin oyuğuna yerleştirin. DMEM-10 complete kullanarak kemik iliğini temizleyin. Ortamı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek topakları yeniden askıya alın
.
- Hücreleri 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın. Bu noktada, hücreleri ya %90 FBS + %10 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanarak dondurun ya da L929 şartlandırılmış ortam kullanarak makrofajları ayırt etmek için hücreleri 15 cm'lik bir Petri kabında kaplayın (adım 2.1).
2. Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Farklılaşması
- Önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı (Swanson ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi 21 mL DMEM-10 tam ve 9 mL L929 hücre şartlandırılmış ortam) kullanarak, kemik iliği hücrelerini 15 cm'lik doku kültürü ile muamele edilmemiş bir Petri kabına koyun (1.2-1.5 x 107 hücre). Plakayı 37 ° C ve% 5 karbondioksit veya CO2'de 7 gün boyunca inkübe edin. 3. veya 4. günde plakaya 30 mL daha farklılaşma ortamı ekleyin.
not: Makrofajların ayrılması ve toplanması zor olacağından doku kültürü ile muamele edilmiş plakaların kullanılmaması önemlidir.
- Makrofajları toplamak için plakayı fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve 20 mL soğuk PBS + 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin. Plakayı 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. PBS + EDTA'yı hücrelerin üzerine pipetleyerek ve plakayı 10 mL PBS ile yıkayarak hücreleri hasat edin. Her iki yıkamayı iki adet 15 mL'lik konik tüpte birleştirin.
- Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve hücreleri 10 mL fenol-kırmızı serbest DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg / mL L-glutamin + 0.05 mM 2-merkaptoetanol +% 5 FBS (DMEM-5) içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre veya bir Coulter sayacı kullanarak sayın. Sayım sırasında hücreleri buz üzerinde tutun.
- Makrofajları doku kültürü kaplı plakalarda 2 x 105 hücre / mL'de tohumlayın. Mikroskopi deneyleri için, 24 oyuklu plakada lameller üzerine 1 mL hücre tohumlayın. Laktat dehidrojenaz (LDH) salım deneyleri için, 96 oyuklu bir plakada 100 μL hücre tohumlayın. LDH tahlili için 9 kuyuya tohum atın (işlenmemiş 3 kuyu,% 100 lizis kontrollü 3 kuyu ve deneysel uyaran için 3 kuyu).
- Hücrelerin kuyu boyunca eşit olarak dağıldığından emin olmak için 96 oyuklu plakayı 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Astarlama işlemine başlamadan önce plakayı gece boyunca 37 °C + %5CO2'de inkübe edin.
3. Hazırlama
- Ortamı, 100 ng / mL lipopolisakkarit veya LPS (24 oyuklu plaka için 500 μL veya 96 oyuklu plaka için 50 μL) içeren taze ortam (DMEM-5) ile değiştirin.
not: LPS'de, TLR4 aracılı astarlamayı uyarma yeteneğini etkileyen çeşitli yapısal varyasyonlar vardır. Salmonella minnesota R595 (Re) LPS, birden fazla satıcıdan temin edilebilir ve önerilir.
- Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3 saat inkübe edin.
4. NLRP3 İnflamozomunun Nigericin ile Aktivasyonu ve FAM-YVAD-FMK ile Etiketleme
- Ortamı çıkarın ve 5 μM nigerisin ve 5 mM glisin içeren 290 μL DMEM-5 ile değiştirin. Kaspaz-1 aktivasyonu sırasında meydana gelen hücre lizis miktarını azaltmak için glisin eklenir. 37 ° C ve% 5 CO2'de 60 dakika inkübe edin. Gözlenen etiketlemenin kaspaz-1'e özgü olduğundan emin olmak için hem vahşi tip hem de kaspaz-1 eksikliği olan makrofajları kullanın.
- Son 45 dakika boyunca, üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış 10 μL 30x FAM-YVAD-FMK ekleyin.
- 60 dakika sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri her biri 1 mL soğuk PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Her oyuğa 250 μL% 2 paraformaldehit ekleyin ve alüminyum folyo ile kaplı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
- Son 5 dakika boyunca, çekirdekleri etiketlemek için 4 μL 0.2 mM uzak kırmızı floresan nükleik asit boyası ekleyin. DNA'yı etiketlemek için 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) veya diğer boyalar da kullanılabilir.
- Hücreleri 1 mL soğuk PBS ile üç kez yıkayın ve lamelleri 7 μL'lik bir solma önleyici montaj ortamı kullanarak mikroskop slaytlarına monte edin. Lameli oje kullanarak mikroskop lamına yapıştırmadan önce montaj ortamının gece boyunca sertleşmesine izin verin.
- Makrofajları konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. FAM-YVAD-FMK için Ex / Em, uzak kırmızı floresan nükleik asit boyası için 492 / 520nm ve 642/661'dir. Mikroskobu, tedavi edilmemiş hücreler 488 kanalında herhangi bir arka plan lekelenmesi göstermeyecek şekilde ayarladığınızdan emin olun. Aksi takdirde, arka plan FAM-YVAD-FMK boyaması algılanır ve gerçek aktif kaspaz-1 algılanmaz.
>5. Etiketli Makrofajların Konfokal Mikroskopi ile Görüntülenmesi
>NOT: Lekeli hücreler, lamellerin gece boyunca kürlenmesine izin verildikten ve oje ile mikroskop lamına kapatıldıktan sonra görüntülenebilir. Burada, konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme açıklanmaktadır. Hücreler ayrıca standart floresan mikroskobu ile de görüntülenebilir.
- İşlenmemiş kontrol hücrelerinin bulunduğu slaydı mikroskop tablasına yerleştirin ve mikroskobu hücrelere odaklayın.
- Mikroskop Arama Tablosu (LUT) ayarlarını kullanarak, ofseti, tedavi edilmemiş hücrelerde pozitif FAM-YVAD-FMK boyaması olmayacak şekilde ayarlayın. Bu işlem kaspaz-1 eksikliği olan makrofajlar kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
not: Deneyde kullanılan her kanal için ofsetin ayarlanması gerekir, ancak doğru ofsetin ayarlanması FAM-YVAD-FMK kanalı ve floresan antikor kanalları için en kritik olanıdır. DNA kanalı için ofset daha az kritiktir. Uzaklık ayarlandıktan sonra, deneyin geri kalanı için bu ayarı değiştirmeyin.
- Slaytı nigerisin ile muamele edilmiş numuneye geçirin. FAM-YVAD-FMK boyama için pozitif ve negatif olan her iki hücreyi de içeren bir alan bulun. FAM-YVAD-FMK kanalının görüntüleme düzlemini, en yüksek pozitif boyama yoğunluğuna sahip düzleme ayarlayın. Bu normalde inflamatuar odağın merkezinin görüntülendiği düzlem olacaktır.
- Kazancı, yoğunlaştırılmış çekirdeğe sahip hücrelerde odaklar görünecek şekilde ayarlayın. Hem kazancı hem de ofseti ayarladıktan sonra, bu ayarları görüntüleme oturumunun geri kalanı için bırakın.
not: Bir hücrenin piroptotik olup olmadığını belirlemenin kolay bir yolu nükleer morfolojiye bakmaktır. Aktif kaspaz-1'e sahip hücreler yuvarlatılmış ve yoğunlaştırılmış çekirdeğe sahipken, nükleoller kaspaz-1 aktivasyonu olmayan hücrelerde görülebilir ve nükleer morfoloji, tedavi edilmemiş hücrelerinkine benzer.
- Toplam 100X büyütme ile rastgele seçilen 5 alanın görüntülerini toplayın. Bu normalde görüntü başına yaklaşık 40 hücre ile sonuçlanır. Her numune için bu işlemi tekrarlayın.
- Görüntü analiz yazılımını kullanarak her görüntüdeki hücre sayısını sayın. Ardından pozitif FAM-YVAD-FMK boyaması olan hücrelerin sayısını sayın. Kaspaz-1 aktivasyon seviyesini FAM-YVAD-FMK pozitif hücrelerin yüzdesi olarak temsil eder.
