$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Farklılaşması
- Önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı (Swanson ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi 21 mL DMEM-10 tam ve 9 mL L929 hücre şartlandırılmış ortam) kullanarak, kemik iliği hücrelerini 15 cm'lik doku kültürü ile muamele edilmemiş bir Petri kabına koyun (1.2-1.5 x 107 hücre). Plakayı 7 gün boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. 3. veya 4.
. günde plakaya 3 mL daha farklılaşma ortamı ekleyin
not: Makrofajların ayrılması ve toplanması zor olacağından doku kültürü ile muamele edilmiş plakaların kullanılmaması önemlidir.
- Makrofajları toplamak için plakayı fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve 20 mL soğuk PBS + 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin. Plakayı 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. PBS + EDTA'yı hücrelerin üzerine pipetleyerek ve plakayı 10 mL PBS ile yıkayarak hücreleri hasat edin. Her iki yıkamayı iki adet 15 mL'lik konik tüpte birleştirin.
- Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve hücreleri 10 mL fenol-kırmızı serbest DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg / mL L-glutamin + 0.05 mM 2-merkaptoetanol +% 5 FBS (DMEM-5) içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre veya bir Coulter sayacı kullanarak sayın. Sayım sırasında hücreleri buz üzerinde tutun.
- Makrofajları doku kültürü kaplı plakalarda 2 x 105 hücre / mL'de tohumlayın. Mikroskopi deneyleri için, 24 oyuklu plakada lameller üzerine 1 mL hücre tohumlayın. LDH salım tahlilleri için, 96 oyuklu bir plakada 100 μL hücre tohumlayın. LDH tahlili için 9 kuyuya tohum atın (işlenmemiş 3 kuyu,% 100 lizis kontrollü 3 kuyu ve deneysel uyaran için 3 kuyu).
- Hücrelerin kuyu boyunca eşit olarak dağıldığından emin olmak için 96 oyuklu plakayı 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Astarlama işlemine başlamadan önce plakayı gece boyunca 37 °C + %5CO2'de inkübe edin.
2. Hazırlama
- Ortamı, 100 ng / mL LPS (24 oyuklu plaka için 500 μL veya 96 oyuklu plaka için 50 μL) içeren taze ortam (DMEM-5) ile değiştirin.
not: LPS'de, TLR4 aracılı astarlamayı uyarma yeteneğini etkileyen çeşitli yapısal varyasyonlar vardır. Salmonella minnesota R595 (Re) LPS, birden fazla satıcıdan temin edilebilir ve önerilir.
- Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3 saat inkübe edin.
>3. NLRP3 İnflamozomunun Nigericin ile aktivasyonu
- Ortamı çıkarın ve 5 μM nigerisin ve 5 mM glisin içeren 290 μL DMEM-5 ile değiştirin. Kaspaz-1 aktivasyonu sırasında meydana gelen hücre lizis miktarını azaltmak için glisin eklenir. 37 ° C ve% 5 CO2'de 60 dakika inkübe edin. Gözlenen etiketlemenin kaspaz-1'e özgü olduğundan emin olmak için hem vahşi tip hem de kaspaz-1 eksikliği olan makrofajları kullanın.
- 60 dakika sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri her biri 1 mL soğuk PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
>4. Antikor Boyama
NOT: ASC'yi tespit etmek için hücreleri antikorlarla etiketlemek, tohumlamak, astarlamak ve hücreleri önceki bölümle aynı şekilde nigerisine maruz bırakmak için. Daha sonraki işlemler aşağıdaki gibidir:
- Hücreleri her biri 1 mL soğuk PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. 250 μL fiksasyon ve geçirgenlik çözeltisi ekleyin. Hücreleri buz üzerinde inkübe edin ve 30 dakika boyunca örtün.
- Makrofajları her biri 1 mL yıkama tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Yıkama tamponunda 1:500 oranında seyreltilmiş ASC'ye karşı 250 μL primer antikor ekleyin ve buz üzerinde 1 saat inkübe edin. Herhangi bir birincil antikor almayan, ancak yalnızca ikincil antikoru alacak bir lamel ekleyin. Bu lamel mikroskop kurulumu sırasında doğru ofseti ayarlamak için kullanılacaktır.
- Hücreleri her biri 1 mL yıkama tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Yıkama tamponunda 1:500 oranında seyreltilmiş 250 μL ikincil antikor (floresan boya konjuge keçi-fare önleyici) ekleyin ve buz üzerinde 1 saat inkübe edin. Çekirdekleri etiketlemek için bu inkübasyonun son 5 dakikası için 4 μL 0.2 mM uzak kırmızı floresan nükleik asit boyası ekleyin.
- Hücreleri 3 kez 1 mL soğuk yıkama tamponu ile yıkayın ve lamelleri 7 μL'lik bir solma önleyici montaj ortamı kullanarak mikroskop slaytlarına monte edin. Şeffaf oje kullanarak lameli mikroskop lamına kapatmadan önce montaj ortamının gece boyunca sertleşmesine izin verin.
- Konfokal mikroskopi ile makrofajları görüntüleyin. İkincil antikor için Ex / Em 555/580 nm ve uzak kırmızı floresan nükleik asit boyası için 642/661'dir.