Nigerisin Maruziyetini Takiben Makrofaj Ölümünü Tespit Etmek İçin Bir Laktat Dehidrojenaz Serbest Bırakma Testi

Özet

Kaynak: den Hartigh, A.B. et al., Murin Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Aktivasyon ve Piroptotik Hücre Ölümünün Tespiti. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, inflamatuar aracılı makrofaj ölümünü tespit etmek için laktat dehidrojenaz testini göstermektedir. Makrofajlar, hazırlama için lipopolisakkarite maruz bırakılır, ardından laktat dehidrojenaz testi ile belirlenen inflamatuar kaynaklı hücre ölümüne neden olmak için nigerisine maruz bırakılır.

Protokol

1. LDH Serbest Bırakma Testi

NOT: LDH salım tahlili için, hücreleri 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Astarlamadan sonra ortamı çıkarmayın.

1. Yapıştırıcı makrofaj hücreleri içeren kuyucuklarda 100 ng/mL LPS içeren ortamı taze ortamla (DMEM-5: 10 mL fenol-kırmızı içermeyen DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-glutamin + 0.05 mM 2-merkaptoetanol +% 5 FBS) değiştirin (24 oyuklu plakalar için 500 μL veya 96 oyuklu plakalar için 50 μL).
   not: LPS'de, TLR4 aracılı astarlamayı uyarma yeteneğini etkileyen çeşitli yapısal varyasyonlar vardır. Salmonella minnesota R595 (Re) den LPS önerilir.
2. Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 3 saat inkübe edin.
3. Deney kuyularına 10 μM nigerisin içeren 50 μL DMEM-5 ve spontan ve% 100 lizis kontrol kuyularına 50 μL DMEM-5 ekleyin. 37 ° C ve% 5 CO_2'de 60 dakika inkübe edin.
4. 30 dakika sonra,% 100 lizis kontrol kuyucuklarına 10 μL 10x lizis tamponu ekleyin ve diğer kuyucuklara 10 μL DMEM-5 ekleyin. Bu inkübasyon sırasında, 1 şişe substrat karışımını (1.5 mL dondurularak kurutulmuş substrat) ve 1 alikot tahlil tamponunu (~ 12 mL) dondurucudan çıkarın ve ışıktan oda sıcaklığına korunarak çözülmelerine izin verin.
   not: Substrat karışımı, kırmızı bir formazan ürününe dönüştürülen bir tetrazolyum tuzu (iyodonitrotetrazolyum menekşesi) içerir.
5. 60 dakikalık toplam inkübasyondan sonra, plakayı 10 ° C'de 500 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. 50 μL süpernatantı şeffaf bir düz tabanlı plakaya aktarın. Bu süre zarfında, substrat karışımı şişesine 12 mL tahlil tamponu ekleyin ve kullanmadan önce oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
6. Her oyuğa 50 μL substrat ekleyin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Boş değerler için yalnızca orta kuyuları dahil edin. Sinyalin plaka okuyucunun algılama sınırını aşmadığından emin olmak için 15 dakika sonra plakayı kontrol edin.
7. 30 dakika sonra 50 μL durdurma çözeltisi (1 M asetik asit) ekleyin ve bir plaka okuyucu kullanarak OD_490'ı ölçün.
8. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre lizis yüzdesini hesaplayın:
   % Sitotoksisite = ((Deneysel - Kendiliğinden)/(Maksimum - Kendiliğinden))×100
   Deneysel: nigerisin ile tedavi edilmiş hücreler; kendiliğinden: tedavi edilmemiş hücreler; maksimum: lizis tamponuna maruz kalan hücreler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cytotox96 Radyoaktif olmayan sitotoksisite testi	Balıkçı Bilimsel	PR-G1780	substrat karışımı ve tahlil tamponu içerir; Tescilli formülasyonlar. Durdurma çözeltisi 1 M Asetik asittir
DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok, fenol kırmızısı yok	Canlandırıcı	31053028
Dulbecco'nun PBS'si, kalsiyum yok, magnezyum yok	Canlandırıcı	14190144
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ABD menşeili	Canlandırıcı	26140079	55 ° C'de 50 dakika boyunca ısıyla etkisiz hale getirilir
Gentamisin	Canlandırıcı	15750060
Salmonella minnesota R595'ten ultra saf LPS (Re)	Liste Biyolojikleri	434
Spectramax M3 plaka okuyucu	Moleküler Cihazlar	5000414
L-Glutamin	Canlandırıcı	21051024

Serisi adet