$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Sağlıklı Nötrofillerin İzolasyonu
- İki adet 10 mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kaplı tüpte sağlıklı bir donörden 20 mL periferik kan alın.
- 50 mL'lik steril bir tüpe 10 mL kan koyun ve 32,5 mL'ye kadar fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
- Hücrelerin altına yoğunluk gradyanı (örneğin, Ficoll-amidotrizoaat) ekleyin.
- 10 mL'lik bir pipet ve pipet kontrolörü ile 14 mL yoğunluk gradyanı alın.
- Pipeti 50 mL'lik tüpün altına yerleştirin.
- Pipet kontrol cihazını pipetten çıkarın, motoru kullanmadan kılcal etki ile maksimuma ulaşılana kadar (1-2 mL kalacaktır) yoğunluk gradyanının yerçekimi ile pipetten dışarı akmasına izin verin.
- Pipetin üzerine bir başparmağınızı yerleştirerek pipeti çıkarın, böylece pipetin çıkarılması sırasında yoğunluk gradyanının dışarı sızmasını önleyin.
- Tüpleri hızlanma veya fren olmadan 912 x g'de ve oda sıcaklığında (RT) 20 dakika döndürün.
NOT: Kırmızı kan hücreleri (RBC) ve nötrofiller yüksek yoğunluğa sahiptir ve 50 mL'lik tüpün dibinde bulunurlar. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) ayrılır ve yoğunluk gradyanının üstünde beyaz bir halka olarak bulunur. PBS ile seyreltilmiş plazma, PBMC'lerin üzerinde olacaktır. Gerekirse, PBMC'ler, beyaz halkanın fosfat tamponlu salin (PBS) ile ek yıkama adımlarıyla yeni bir 50 mL'lik tüpe aktarılmasıyla izole edilebilir.
- Önce PBMC'leri içeren beyaz halkayı dikkatlice çıkarın, ardından PBS ile seyreltilmiş plazmanın çıkarılması ve son olarak yoğunluk gradyan katmanının mümkün olduğunca çıkarılması
.
- Nötrofilleri nötrofil / eritrosit karışımından izole etmek için, eritrositleri soğuk steril damıtılmış su ile parçalayın.
- Buzdolabından soğuk steril damıtılmış bir su şişesi ve 10x konsantre bir PBS şişesi alın.
- Bu adım için hızlı çalışın. Doğrudan peletin üzerine 36 mL soğuk steril damıtılmış su ekleyin ve dikkatlice bir kez karıştırın. İzotonik bir çözelti yapmak için 20 saniye sonra 4 mL 10x PBS ekleyin. Bir kez dikkatlice karıştırın.
- Tüpü 739 x g ve 4 °C'de 5 dakika sıkın (RBC'lerin çıkarılması için). Nötrofiller beyaz topağın içinde olacaktır.
- Süpernatanı dikkatlice atın. Adım 1.6.2'yi tekrar uygulayın ve peletin düzgün şekilde askıya alındığından emin olun.
- Tüpü 328 x g ve 4 °C'de 5 dakika döndürün.
- Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 5 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Nötrofilleri sayın ve buz üzerinde tutun.
NOT: 1 tüp kandan (10 mL) beklenen verim yaklaşık 15-75 milyon nötrofildir.
2. Nötrofillerin Kırmızı Floresan Hücre Etiketlemesi
- 15 mL'lik bir tüpte 2 mL PBS'de 10-20 milyon nötrofillik bir nötrofil süspansiyonu yapın.
- Farklı bir 15 mL tüpte 4 μL 2 μM kırmızı floresan hücre bağlayıcı ile 2 mL PBS'lik bir çözelti yapın (Malzeme Tablosuna bakınız). Bunu nazikçe nötrofil süspansiyonuna ekleyin ve dikkatlice karıştırın.
- Nötrofilleri kırmızı floresan hücre bağlayıcı ile etiketlemek için karanlıkta 37 ° C'de tam olarak 25 dakika inkübe edin.
- RT'de 15 mL'ye kadar% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) içeren Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamını ekleyerek etiketlemeyi etkisiz hale getirin ve bir kez dikkatlice karıştırın. Bir pelet oluşmuşsa, peletin dikkatlice yeniden askıya alındığından emin olun.
- Tüpü 328 x g ve RT'de 5 dakika döndürün.
- Süpernatanı çıkarın ve peleti RT'de %2 FBS ve %10 Penisilin / streptomisin (P / S) içeren 5 mL fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. Nötrofilleri sayın.
not: Kırmızı floresan hücre etiketlemesinden sonra %50'lik bir hücre kaybı meydana gelebilir.
3. Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Oluşumunun İndüksiyonu
- %2 FBS ve %10 P/S içeren fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ortamında 0.42 x10 6 hücre/mL'lik bir hücre süspansiyonu yapın.
- Siyah 96 oyuklu, düz tabanlı bir plakaya oyuk başına 90 μL'de 37.500 nötrofil ekleyin.
- Seçilen uyaranın 10 μL'sini ekleyin (ör., bir hastanın serumu) kuyucukta% 10'luk bir konsantrasyona ulaşmak için üç kopya halinde. Her zaman üç nüsha halinde bir negatif kontrol (orta) ekleyin.
- Karanlıkta 37 ° C'de 30 dakika ila 2, 4 veya 6 saat arasında değişen istenen süre boyunca inkübe edin ve 4 saat inkübe edilmesi önerilir.
- Kuyucukta 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 25 μL 5 μM geçirimsiz DNA boyası eklemek için gereken hacmi hesaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Gerekirse, 5 μM konsantrasyon elde etmek için %2 FBS ve %10 P/S içeren RPMI 1640 ortamında bir ön seyreltme yapın.
- İnkübasyon süresinin bitiminden 15 dakika önce 25 μL 5 μM geçirimsiz DNA boyası ekleyin. Karanlıkta 37 °C'de 15 dakika daha inkübasyona devam edin.
- Süpernatanı (~ 125 μL) çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve gerekirse saklayın. 100 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Karanlıkta kalın ve hemen 4. adımla devam edin.
4. Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET) 3D Yüksek İçerikli, Yüksek Çözünürlüklü İmmünofloresan Konfokal Mikroskopi ile Görselleştirme
- Edinme kurulumuna tıklayarak immünofloresan konfokal mikroskop üzerindeki ayarları yapılandırın.
- Yapılandır sekmesine tıklayın.
- Hedefi ve kamerayı seçin. Konfokal 60 μm iğne deliği çekim moduna sahip 10X Apo Lambda objektifini seçin.
- Plakaya tıklayın ve 96 oyuklu plastik plakayı seçin. Ziyaret edilecek siteleri seçin ve sabit sayıda site seçin. Kuyunun toplam% 45'ini kaplayan 3 sütun ve 3 satırı üst üste binmeden (0 μm) doldurun.
- Satın Alma'ya tıklayın. Lazer Tabanlı Odaklamayı Etkinleştir'i seçin. Gerekirse Z Serisi/Zaman Serisi Al'ı seçin.
- Site Otomatik Odaklama'ya tıklayın.
- Plaka Altına Odaklan | Alt Kalınlık ile Ofset'e tıklayın. Numuneyi bulmak için ilk kuyu için, elde edilen ilk kuyuyu seçin. Site otomatik odaklaması için tüm siteler'i seçin.
- Dalga boyları'na tıklayın.
- Dalga boyu sayısı için 2'yi seçin. TL gölgelendirme düzeltmesi iyileştirme düzeyi için 2'yi seçin.
- Dalga Boyu 1 için Texas Red'i seçin.
- Otomatik odaklama seçenekleri için, Z ofsetli lazeri, 1,1 μm lazer sonrası ofsetini seçin. 200-10 özel aralığına sahip Z yığınını kullanın.
- Dalga Boyu 2 için floresein izotiyosiyanat (FITC) seçin.
- Otomatik odaklama seçenekleri için, w1 0 μm'den Z ofsetli lazeri seçin. 200-10 özel aralığına sahip Z yığınını kullanın.
- Çekim seçenekleri için maksimum Z serisi ve 2D projeksiyon görüntüsü öğesini seçin. Alım seçenekleri için Gölgelendirme Düzeltme | Kapalı.
- Z Serisi'ni seçin. Adım sayısını seçin: 10. Adım boyutunu seçin: 3 μm (toplam aralık 27 μm olacaktır).
- Plakayı immünofloresan konfokal mikroskopiye yerleştirin.
- Çalıştır sekmesine tıklayın.
- Plaka adını ve açıklamasını doldurun ve saklama yerini seçin.
- Edinilmesi gereken kuyuları seçin.
- Texas Red ve FITC için pozlama süresini seçin.
- Plaka başına yaklaşık 1 saat sürecek olan satın alma işlemini başlatmak için Plaka Al'a tıklayın.
5. NET Oluşumunun Analizi
- NET oluşumunu analiz etmek için bilimsel çok boyutlu görüntülerin analizi için tasarlanmış bir görüntü işleme programı kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Alınan görüntü verilerini ayrı bir sabit sürücüye aktarın.
- Renk ekleme aracını seçin.
- w1'i seçin ve sabit sürücüde verilerin depolandığı klasörü seçin.
- w2'yi seçin ve sabit sürücüde verilerin depolandığı klasörü seçin.
not: Texas Red görüntülerine kırmızı renk eklemek için dosya adında w1 kullanan ve FITC görüntülerine yeşil renk eklemek için w2 kullanan standart bir makro kullanın.
- Analiz Makrosu'nu seçin.
- w1'i seçin ve genellikle 10 olan eşik değerini (yoğunluk eşiği) seçin. İstediğiniz piksel değerini seçin (boyut eşiği, örn. 100).
- w2'yi seçin ve genellikle 10 olan eşik değerini (yoğunluk eşiği) seçin. İstediğiniz piksel değerini seçin (boyut eşiği, ör. 500).
- Elektronik tablo dosyası için hedefi seçin, analizi çalıştırın ve daha sonra günlük dosyalarını kaydedin.
- Bir elektronik tablodaki verileri analiz edin.