Önceden Etiketlenmiş Nötrofillerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İndüksiyonu ve Görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Arends, E. J. et al., Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Oluşumunu Değerlendirmek ve Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Test.J. Vis. Uzm.(2019)

Bu video, anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar içeren hasta serumu kullanılarak önceden etiketlenmiş nötrofillerde nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin indüksiyonunu ve görselleştirilmesini göstermektedir. Ayrıca, geçirimsiz bir DNA boyası ve floresan mikroskobu kullanmak, NET'lerin görüntülenmesini sağlar.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Sağlıklı Nötrofillerin İzolasyonu

1. İki adet 10 mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kaplı tüpte sağlıklı bir donörden 20 mL periferik kan alın.
2. 50 mL'lik steril bir tüpe 10 mL kan koyun ve 32,5 mL'ye kadar fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
3. Hücrelerin altına yoğunluk gradyanı (örneğin, Ficoll-amidotrizoaat) ekleyin.
   1. 10 mL'lik bir pipet ve pipet kontrolörü ile 14 mL....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aqua Steril H2O	B. Braun, Melsungen, Almanya	12604052
Fetal sığır serumu (FBS)	Bodinco, Alkmaar, Hollanda		Yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında NET oluşumunu etkileyebilir
Ficoll% 5,7 - amidotrizoaat% 9 yoğunluk 1.077 g / mL	LUMC, Leiden, Hollanda	97902861
İmmünofloresan konfokal mikroskop	Görüntü: Xpress Micro Confocal (Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA, ABD)
Nötralizasyon PBS (10x)	Gibco, Paisley, Birleşik Krallık	70011-036
Penisilin / streptomisin (p/s)	Gibco, Paisley, Birleşik Krallık	15070063
Fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 (1x)	Gibco, Paisley, Birleşik Krallık	11835-063	Fenol kırmızısı, immünofloresan sinyalini etkileyebilir
Fosfat tamponlu salin (PBS)	B. Braun, Melsungen, Almanya	174628062
PKH26 2 uM Kırmızı floresan hücre bağlayıcı	Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	PKH26GL-1KT	PKH, patentli floresan boyalar ve kaşifleri Paul Karl Horan'ın adını taşıyan bir hücre etiketleme teknolojisidir
Bilimsel çok boyutlu görüntü analizi programı	ImageJ, Araştırma Hizmetleri Şubesi, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü, Bethesda, Maryland, ABD
RPMI orta 1640 (1x)	Gibco, Paisley, Birleşik Krallık	52400-025
Sytox yeşili 5 mM Geçirimsiz DNA boyası	Gibco, Paisley, Birleşik Krallık	57020
Tripan mavisi lekesi %0,4	Sigma Aldrich, Almanya	17942E
96 oyuklu, siyah, düz tabanlı, doku kültürü ile tedavi edilmiş plaka	Şahin, NY, Amerika Birleşik Devletleri	353219

Haber Bülteni