İnsan Kanından Elde Edilen Nötrofillerden Lipitlerin Bifazik Ayırma ile İzolasyonu

Özet

Kaynak: Brogden, G., et al. Nötrofillerdeki lipid değişikliklerini ve ardından nötrofil hücre dışı tuzakların oluşumunu inceleme yöntemleri. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, metanol ve kloroform kullanan iki fazlı bir çözücü sistemi ile insan nötrofillerinden lipid izolasyonunu göstermektedir.

Protokol

1. İnsan Kanından Elde Edilen Nötrofillerin Lipid İzolasyonu ve Analizi

1. Nötrofilleri alın ve buzun üzerine koyun.
2. Buzun üzerinde, nötrofilleri (metanol ve kloroform çözeltisinde bulunur) politetrafloroetilen (PTFE) contalı 15 mL'lik vidalı kapaklı bir cam tüpe pipetleyin ve 1 dakika çalkalayarak homojenize edin. Lipitlerin plastik yüzeylere yapışmasını önlemek için cam tüpler kullanın. Kauçuk/plastikten kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için PTFE kapaklar kullanın.
3. 2 mL metanol ve ardından 1 dakika sonra 1 mL kloroform ekleyin. Tekrar 1 dakika çalkalayın.
4. Cam tüpleri RT ve 50 rpm'de 30 dakika döndürün.
5. Çözeltiyi 7 °C'de ve 1.952 x g'da 10 dakika santrifüjleyerek protein fraksiyonunu peletleyin.
6. Süpernatanı, protein içeren peleti geride bırakarak 15 mL'lik yeni bir cam vidalı kapaklı tüpe dikkatlice boşaltın. Gelecekteki miktar tayini için peleti -20 °C'de saklayın.
7. 1 mL kloroform ekleyin, 1 dakika bekleyin, 1 mL çift damıtılmış su ekleyin ve numune ile birlikte cam vidalı kapağı 30 saniye ters çevirin.
8. 7 ° C'de ve 1,952 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve üst fazı, bulutlu tabaka dahil değil, aşağı atın.
9. Gerekirse, adım 1.1.8'i tekrarlayarak isteğe bağlı bir daha saflaştırma adımı gerçekleştirin.
10. Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcıda 60 °C'de kurutun ve gerekli olana kadar -20 °C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 μl şırınga	Hamilton	701 NR 10 μl
Kanül 26G	Braun	4657683
kloroform	Carl Roth'un fotoğrafı	7331.1
metanol	Carl Roth'un fotoğrafı	7342.1
Su	Carl Roth'un fotoğrafı	3255.1	Endotoksin içermez

. . sayılı Kanun .