Makrofajlarda Cryptococcus neoformans Enfeksiyonunu Tespit Etmek için Bir Laktat Dehidrojenaz Serbest Bırakma Testi

Özet

Kaynak: Ball, B., et al. Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Kantitatif Proteomik İş Akışı. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, patojenik bir mantar olan Cryptococcus neoformans'ın makrofajlardaki enfeksiyonunu değerlendirmek için bir sitotoksisite testi gösteriyoruz. Sitotoksisite, Cryptococcus neoformans enfeksiyonunun neden olduğu makrofaj lizizine bağlı olarak sitoplazmik laktat dehidrojenaz enziminin salınmasıyla belirlenir.

Protokol

1. Enfeksiyonun doğrulanması

>NOT: Bir sitotoksisite testi kullanılarak enfeksiyon yeterliliği ölçülebilir. Aşağıdaki protokol, LDH (laktat dehidrojenaz) salınımını ölçmek için bir sitotoksisite ürününün uygulamasını vurgulayacaktır. Diğer sitotoksisite ürünleri de kullanılabilir

1. Makrofaj hücrelerinin C. neoformans enfeksiyonunun hazırlanması
   1. Mantar hücrelerinin hazırlanması
      1. Bir gliserol stoğu kullanarak, tek kolonileri izole etmek için Maya özütü pepton dekstroz (YPD) agar plakası üzerine vahşi tip C. neoformans suşu (H99) çizin.
      2. Statik bir inkübatörde 37 ° C'de 16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
      3. Yabani tip C. neoformans suşunun tek bir kolonisini seçin ve gevşek kapaklı 10 mL'lik bir test tüpünde 5 mL YPD suyunda kültürleyin. Dörtlü olarak gerçekleştirin.
      4. 200 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde 37 ° C'de 16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
      5. Ertesi gün, her gece kültürü 1:100 oranında seyrelterek 3 mL YPD et suyuna alt kültürler oluşturur.
      6. Orta log fazını belirlemek için mantar kültürünün Optik yoğunluk (OD_600nm) değerlerini ölçün. Spektrofotometreye bağlı olarak, C. neoformans vahşi tip suşu, genel OD_600nm değerleri 1.0 ila 1.5 arasında değişen YPD'de 6 ila 8 saatlik inkübasyondan sonra yaygın olarak orta log fazına ulaşır.
      7. Hücreler orta log fazına ulaştığında, temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne 10 μL'lik bir mantar hücresi süspansiyonu alın ve steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:100 oranında seyreltin. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.
      8. Hücreleri 10 dakika boyunca 1.500 x g'da toplayın ve santrifüjleyin, peleti steril oda sıcaklığında PBS ile nazikçe yıkayın ve toplam üç yıkama için tekrarlayın.
      9. 1.2 x 10⁸ hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için hücreleri antibiyotik içermeyen bir hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.
   2. Makrofaj hücrelerinin hazırlanması
      1. Hücrelerin% 70-80 birleşmesine ulaştığından emin olmak için 6 oyuklu plakadaki her bir oyuğu görselleştirin. Alternatif olarak, hücreler kuyu başına yaklaşık 1.2 x 10⁶ makrofaj hücresi elde etmek için ölçülebilir.
      2. Hücre kültürü çalışmasından önce antibiyotik takviyeli ortamı 37 °C'ye ısıtın. Hücre kültürü çalışmasından önce çalışma ortamının sterilize edildiğinden emin olun. Hücrelerin yapışık ve sağlıklı olduğundan emin olmak için bir ışık mikroskobu kullanarak hücreleri görselleştirin.
      3. Hücre kültürü ortamını serolojik bir pipet veya vakum aspiratörü ile tabaktan çıkarın.
      4. 60 x 15 mm'lik tabağa yavaşça 5-7 mL steril oda sıcaklığında PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) ekleyin.
      5. Yapışmış hücreleri yıkamak için tabağı yavaşça eğin.
   3. C. neoformans ve makrofaj hücrelerinin ko-kültürü
      1. Makrofaj hücreleri içeren 4 oyuğa 1 mL yeniden süspanse C. neoformans hücresi ekleyin.
         not: Deneye başlamadan önce gerekli plaka sayısının hesaplanması gerekecektir. Boş kuyucuklara 1 mL antibiyotik içermeyen ortam ekleyin.
      2. Hücrelerin 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 3 saat inkübe etmesine izin verin.
      3. Hücre kültürü ortamını serolojik bir pipet veya bir vakum aspiratörü ile plakadan çıkarın.
      4. Yavaşça 1 mL steril oda sıcaklığında PBS ekleyin.
      5. Bağlanmamış veya fagositozlanmamış hücre dışı C. neoformans hücrelerini yıkamak için plakayı hafifçe eğin.
      6. 6 oyuklu plakadaki her oyuğa 1 mL antibiyotik içermeyen ortam ekleyin.
      7. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.
   4. Seçilen zaman noktalarında (örn. 1, 3, 6, 12 ve 24 saat) üreticinin talimatlarına göre LDH salınımının ölçümü için süpernatan toplayın.
   5. Aynı zaman noktalarında, enfekte olmamış makrofaj hücreleri, maksimum sitotoksisite için belirlenen bir değere parçalanacaktır.
   6. Sitotoksisiteyi aşağıdaki gibi hesaplayın:
      

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 mM Tris-HCl, pH 8.5	Balıkçı Bilimsel	BP152-1	4 ° C'de koruyun
60 x 15 mm Çanak, Nunclon Delta	ThermoFisher Bilimsel	174888
6 oyuklu hücre kültürü plakası	ThermoFisher Bilimsel	140675
Konik şahin tüpleri (15 mL)	Balıkçı Bilimsel	05-539-12
Kontes II Otomatik Hücre Sayacı	ThermoFisher Bilimsel	AMQAX1000	Zorunlu değildir, hemositometre alternatif olarak kullanılabilir.
CytoTox 96 Radyoaktif Olmayan Sitotoksisite Testi	Promega	G1780
DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi	ThermoFisher Bilimsel	10566016
Fetal Sığır Serumu (FBS)	ThermoFisher Bilimsel	12483020	60 ° C'de 30 dakika inkübe ederek ısıtın. 50 ml alikot hazırlayın ve hızlı dondurun. Medya hazırlığından önce çözün
Hemositometre	VWR (VWR)	15170-208
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma Aldrich	H3375	40 mM HEPES / 8 M Üre'yi toplu stok solüsyonunda hazırlayın, hızlı dondurun, kullanana kadar -20 ° C'de saklayın. Her kullanımdan sonra atın (tekrar tekrar dondurmayın-çözmeyin).
L-glutamin	ThermoFisher Bilimsel	25030081	Depolama için alikot ve donmuş olabilir. Medya hazırlamadan önce çözdürün.
Mikrosantrifüj	Eppendorf Belediyesi	13864457
Penisilin : Streptomisin 10k/10k	VWR (VWR)	CA12001-692	Depolama için alikot ve donmuş olabilir. Medya hazırlamadan önce çözdürün.
Fosfat Tamponlu Tuzlu	VWR (VWR)	CA12001-676	Satın alma gerekli değildir. PBS de hazırlanabilir, ancak kullanımdan önce steril filtreleme yapılmalıdır.
Pipet, Tek Kullanımlık Serolojik (10 mL)	Balıkçı Bilimsel	13-678-11E
Pipet, Tek Kullanımlık Serolojik (25 mL) Basix	Balıkçı Bilimsel	14955235
Tripsin / Lys-C proteaz karışımı, MS derecesi	delmek	A40007	-20 °C'de muhafaza edin.
üre	Sigma Aldrich	U1250-1KG	40 mM HEPES/8 M Üre'yi toplu stok solüsyonunda hazırlayın, hızlı dondurun, kullanana kadar -20 °C'de saklayın. Her kullanımdan sonra atın (tekrar tekrar dondurmayın-çözmeyin).
Maya özü pepton dekstroz suyu	BD Difco	BM20