Bakteriyel toksinlerin etkisini incelemek için geçirgen membran insert tabanlı bir enfeksiyon sistemi

Abstract

Kaynak: Flaherty, R. A., et al. Salgılanan Bakteriyel Toksinlerin Memeli Konak Hücreleri Üzerindeki Etkilerini İncelemek için Geçirgen Membran Ekleme Tabanlı Bir Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu videoda, salgılanan bakteri toksinlerinin etkisini değerlendirmek için geçirgen membran eki tabanlı bir enfeksiyon sistemi gösterilmektedir. Bu teknik, geçirgen bir zar kullanarak bakteriyel patojen ile konakçı hücreler arasındaki doğrudan teması ortadan kaldırarak, patojenik bakteriler tarafından salgılanan toksinlerin memeli konakçı hücreleri üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir.

Protocol

1. Bakteri Kültürü

1. İlgilenilen spesifik salgılanan faktörün incelenmesi için kullanılacak izojenik mutant suşlar oluşturun.
   not: Bu deneyler için kullanılan GAS (Grup A Streptokok) M1T1 5448 suşları, bir sagAΔkedisi SLS eksikliği olan WT (Vahşi tip) GAS' (sag = Streptolysin S ile ilişkili gen, SLS = Streptolysin S) mutantı (metinde ΔsagA olarak kısaltılır) ve bir sagA tamamlayıcı suşu (metinde ΔsagA+sagA olarak kısaltılır) içerir.
2. İlgilenilen bakteri suşlarının gece boyunca sıvı kültürlerini hazırlayın. İnsan hücrelerini enfekte etmeden önce GAS M1T1 5448 suşlarını 10 ml Todd-Hewitt suyunda 37 ° C'de 16-20 saat büyütün.
3. Gece boyunca bakteri kültürlerini (10 dakika boyunca 2.400 rcf) santrifüjleyin ve taze bakteri ortamında yeniden süspanse edin.
   not: Gece boyunca kültürlerin büyütüldüğü (5-10 ml) ile aynı hacimde yeniden süspansiyon, genellikle arzu edilen bir başlangıç optik yoğunluğu üretir.
4. Test edilecek tüm suşlar için 600 nm'de (OD₆₀₀) aynı optik yoğunluk elde edilene kadar yeniden süspanse edilmiş kültürleri ek bakteri ortamında seyrelterek bakteri kültürlerini eşit başlangıç konsantrasyonlarına normalleştirin (kolaylık sağlamak için yaklaşık 1.0 OD₆₀₀ önerilir).
   not: Bu çalışmalarda, normalizasyonun hemen ardından konakçı hücreleri enfekte etmek için durağan faz bakteri kültürleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, bazı bakteri suşları senkron olmayan bir şekilde durağan fazdan çıktıklarından, ilgilenilen suşlar için durumun böyle olduğu tespit edilirse, konak enfeksiyonlarına log faz kültürleriyle başlamak daha uygun olabilir.
5. Daha fazla analizden önce, başlangıç kültürlerinde bulunan mililitre başına koloni oluşturan birimleri (CFU) belirlemek için bir koloni sayım testi yapın, böylece enfeksiyon çokluğu (MOI) veya konakçı hücre başına bakteri oranı belirlenebilir.
   1. Fosfat tamponlu salin (PBS) veya uygun bakteri üreme ortamında istenen optik yoğunluğa normalize edilmiş 1 ml seri bakteri kültürü seyreltmelerini hazırlayın (bu çalışmalarda Todd-Hewitt suyu kullanılmıştır). Sayılabilir kolonilere (30-300 koloni) sahip en az bir set agar plakası üretmek için ^10-1 ila ^10-6 arasında değişen seyreltmeler hazırlayın. Tüm seyreltmeleri üç nüsha halinde gerçekleştirin.
   2. Her seri seyreltmenin 100 μl'sini, analiz edilen bakteri türü için uygun ortamı içeren bir agar plakasına aktarın.
      not: Bu çalışmalarda Todd-Hewitt agar kullanıldı.
   3. 100 μl'lik alikotu agar plakasının tüm yüzeyine eşit olarak dağıtmak için bir cam veya plastik bakteri yayıcı kullanın ve sıvı agar içine emilene kadar yayılmaya devam edin. Steril bir teknik kullanarak alev altında gerçekleştirin.
   4. Agar plakalarını gece boyunca veya sayılabilir koloniler ortaya çıkana kadar 37 °C'de inkübe edin.
   5. Her plakada büyüyen kolonileri sayın ve orijinal kültürdeki CFU/ml'yi aşağıdaki formülle hesaplayın: koloni sayısı x mililitre cinsinden kaplanmış seri seyreltme/kültür hacminin tersi.
      örneğin (200 koloni x 1/^10-5 seyreltme) / 0.1 ml kaplama = 2.0 x 10⁸ CFU/ml.

2. Konak Hücre Kültürü

1. İstenen analizler için uygun bir konak hücre hattı elde edin.
   not: Bu çalışmalar için V. Nizet'in nazik bir armağanı olan HaCaT insan epitelyal keratinositleri kullanılmıştır.
   1. HaCaT hücrelerini% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unda (DMEM) 100 mm'lik kültür kaplarında koruyun. 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.

3. Geçirgen Membran Ekleme Sistemi ile Konak Hücre Enfeksiyonu

1. Hücreleri uygun doku kültürü kaplarında plakalayın ve %90 birleşmeye ulaşana kadar büyümelerine izin verin.
   not: Bu çalışmalarda kullanılan HaCaT hücreleri tipik olarak kaplamadan sonraki 2-3 gün içinde birleşir.
   1. Lizat toplama için (örn. sinyal analizi ve adenozin trifosfat (ATP) belirleme deneyleri), HaCaT hücrelerini yaklaşık 3 x 10⁵ hücre/kuyucuk tohumlama yoğunluğunda 6 oyuklu tabakta plakalayın.
   2. İmmünofloresan görüntüleme deneyleri için, yaklaşık 3 x 10⁵ hücre/kuyucuk tohumlama yoğunluğunda 6 oyuklu çanak içinde steril cam lameller üzerindeki plaka hücreleri.
   3. Etidyum homodimer membran geçirgenliği ve laktat dehidrojenaz (LDH) salım testleri için, HaCaT hücrelerini yaklaşık 5 x 10⁴ hücre / kuyucuk tohumlama yoğunluğunda 24 oyuklu tabakta plakalayın.
2. Tedaviden hemen önce, hücreleri 1x steril PBS ile yıkayın.
3. Hücrelere taze büyüme ortamı uygulayın. Burada açıklanan koşullar için, 6 oyuklu plaka için oyuk başına 2 ml ortam veya 24 oyuklu plaka için oyuk başına 0,5 ml ortam uygulayın. Farmakolojik tedaviler test ediliyorsa, taze besiyeri ile karıştırın ve bu adımda uygulayın.
   Not: Bazı tahliller alternatif ortam gerektirebilir. Örneğin, fenol kırmızısı ve yüksek serum konsantrasyonları LDH salınım testine müdahale ettiğinden, fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco'nun modifiye edilmiş kartal ortamı (DMEM)% 1 sığır serum albümini (BSA) (a / h), 2 mM L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat ile desteklenmiştir.
4. Taze ortam uygulandıktan sonra, her bir oyuğa dikkatlice steril bir 0,4 μm geçirgen membran eki yerleştirin. Bu adımı laminer bir akış başlığında gerçekleştirin ve geçirgen membran ekini her bir oyuğa aktarmak için steril forseps kullanın.
5. Üreticinin talimatlarına göre her bir oyuğun üst odasına taze hücre kültürü ortamı uygulayın. Burada açıklanan koşullar için, 6 oyuklu plaka için oyuk başına 1 ml ortam veya 24 oyuklu plaka için oyuk başına 0.1 ml ortam uygulayın.
6. Geçirgen membran ekleme sisteminin üst bölmesine uygun hacimde normalleştirilmiş bakteri kültürleri (bkz. bölüm 1) uygulayın. Enfekte olmamış kontrol tedavileri için bakteriyel bir ortam kullanın. Burada açıklanan sonuçlar için, 24 oyuklu plaka için oda başına 25 μl normalleştirilmiş kültür ve 6 oyuklu plaka için oda başına 100 μl kültür ekleyin.
   Not: Bu çalışmalarda, konakçı hücrelere 10 MOI'de vahşi tip veya mutant GAS uygulanmıştır. MOI, nihai ökaryotik hücre sayılarına (örneğin 2 x 10⁶ hücre / kuyucuk) dayalı olarak hesaplandı, böylece enfeksiyon döneminin başlangıcında konak hücre başına 10 kat daha fazla bakteri eklendi (ör. kuyucuk başına 2 x 10⁷ CFU). Uygun MOI, farklı bakteri türlerine ve istenen takip analizlerine göre değişecektir.
   not: Enfekte olmamış kontroller için bakteri ortamının kullanılmasına ek olarak, bu tekniğin belirli uygulamaları için diğer yararlı kontroller, karşılaştırma için ısıyla öldürülmüş bakterileri veya kullanılmış bakteri ortamını içerebilir.
7. Enfekte olmuş hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.

4. Örnek Toplama

1. Takip analizleri için hücre kültürü ortamını, konakçı hücre lizatlarını veya bozulmamış hücrelere sahip cam lameller toplamak için, geçirgen zar ekini steril forseps ile dikkatlice çıkararak başlayın.
2. Salgılanan konak proteinlerinin değerlendirilmesi için:
   1. Ortamı alt hazneden 1,5 ml'lik tüplere toplayın. Toplama sırasında tek katmanı rahatsız etmekten kaçının.
   2. Hücresel kalıntıları gidermek için numuneleri 14.000 rcf'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   3. Süpernatanın 50 μl'si hariç tümünü 1.5 ml'lik yeni bir tüpe çıkarın ve -20 °C'de saklayın veya hemen kullanın.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt suyu	Acumedia (Acıbadem Çiçeği	7161bir	İlgilendiğiniz bakteri türleri için uygun et suyu kullanın.
Biyospektrometre	Eppendorf Belediyesi	Temel model	Herhangi bir UV-Vis spektrofotometresi uygundur.
Petri Kapları	Balıkçı Bilimsel	FB0875713	Diğer markalar uygundur.
Ağar	Sigma	A1296-1kg	Diğer markalar uygundur.
HaCaT insan epitelyal keratinositleri			Victor Nizet'in laboratuvarından hediye.
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Yaşam Teknolojileri	11995-073	İlgilenilen hücre hattı için uygun ortamı kullanın.
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Biyobatı	S162H Serisi	İlgilenilen hücre hattı için uygun ortam katkı maddeleri kullanın.
10cm doku kültürü kapları	Nunc (Rahibe)	150350	Diğer markalar uygundur.
6 oyuklu doku kültürü kapları	SitoOne	cc7682-7506	Diğer markalar uygundur ancak Corning kesici uç ile uyumlu olmaları gerekir.
24 oyuklu doku kültürü kapları	SitoOne	cc7682-7524	Diğer markalar uygundur ancak Corning kesici uç ile uyumlu olmaları gerekir.
Cam lameller	Balıkçı markası	12-541-B	Bunlar, hücre kaplaması için kullanılmadan önce otoklavlanmalıdır.
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	Gibco (Gibco)	10010-023
Fenol Kırmızısı İçermeyen DMEM	Yaşam Teknolojileri	31053028	Fenol Kırmızısı İçermeyen ortam yalnızca LDH salınım testi için gereklidir.
Sığır Serum Albümini (BSA)	Balıkçı Bilimsel	BP1600-100
L-glutamin	Gibco (Gibco)	25030149	Sadece LDH salınım testi için hücre kültürü ortamını desteklemek için gereklidir.
Sodyum piruvat	Gibco (Gibco)	BP356100	Sadece LDH salınım testi için hücre kültürü ortamını desteklemek için gereklidir.
Kollajen kaplı 0.4μm Transwell ekleri (6 kuyulu)	Corning	3540
Kollajen kaplı 0.4μm Transwell ekleri (24 kuyulu)	Corning	3595
Forseps	balıkçı	3120018	Transwell eklerini teslim etmeden önce bunlar etanol ile sterilize edilmelidir.
Hücre sıyırıcılar	Balıkçı markası	08-100-241	Bunlar sadece hücre lizatlarının toplanması için gereklidir.