Geçirgen Bir Membran Sisteminde Kültürlenmiş Enfekte Konak Hücrelerden Konak Hücre Lizatının Ekstraksiyonu

Özet

Kaynak: Flaherty, R. A., et al. Salgılanan Bakteriyel Toksinlerin Memeli Konak Hücreleri Üzerindeki Etkilerini İncelemek İçin Geçirgen Membran Ekleme Tabanlı Bir Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, bakteriyel toksinlerin konakçı hücreler üzerindeki etkisini kontrollü ve izole bir şekilde araştırmak için geçirgen bir membran ekleme sistemini göstermektedir. Bu yaklaşım, doğal konakçı-patojen etkileşimini taklit eden fiziksel bir ayrımı korurken, hücrelerin toksinlere seçici olarak maruz kalmasına izin verir.

Protokol

1. Bakteri Kültürü

1. İlgilenilen spesifik salgılanan faktörün incelenmesi için kullanılacak izojenik mutant suşlar oluşturun.
   not: Bu deneyler için kullanılan GASM1T1 5448 Streptococcus suşları, bir sagAΔcat SLS eksikliği olan mutant (metinde ΔsagA olarak kısaltılmıştır) ve bir sagA tamamlayıcı suşu (metinde ΔsagA+sagA olarak kısaltılmıştır) içeren WT GAS'ı içeriyordu.
2. İlgilenilen bakteri suşlarının gece boyunca sıvı kültürlerini hazırlayın. GAS M1T1 5448 suşlarını, insan hücrelerini enfekte etmeden önce 16-20 saat boyunca 37 ° C'de -10 ml Todd-Hewitt suyunda büyütün.
3. Gece boyunca bakteri kültürlerini (10 dakika boyunca 2.400 rcf) santrifüjleyin ve taze bakteri ortamında yeniden süspanse edin.
   not: Gece boyunca kültürlerin büyütüldüğü (5-10 ml) ile aynı hacimde yeniden süspansiyon, genellikle arzu edilen bir başlangıç optik yoğunluğu üretir.
4. Test edilecek tüm suşlar için 600 nm'de (OD600) aynı optik yoğunluk elde edilene kadar yeniden süspanse edilmiş kültürleri ek bakteri ortamında seyrelterek bakteri kültürlerini eşit başlangıç konsantrasyonlarına normalleştirin (kolaylık sağlamak için yaklaşık 1.0 OD600 önerilir).
   not: Bu çalışmalarda, normalizasyonun hemen ardından konakçı hücreleri enfekte etmek için durağan faz bakteri kültürleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, bazı bakteri suşları senkron olmayan bir şekilde durağan fazdan çıktıklarından, ilgilenilen suşlar için durumun böyle olduğu tespit edilirse, konak enfeksiyonlarına log faz kültürleriyle başlamak daha uygun olabilir.
5. Daha fazla analizden önce, başlangıç kültürlerinde bulunan mililitre başına koloni oluşturan birimleri (CFU) belirlemek için bir koloni sayım testi yapın, böylece enfeksiyon çokluğu (MOI) veya konakçı hücre başına bakteri oranı belirlenebilir.
   1. Fosfat tamponlu salin (PBS) veya uygun bakteri üreme ortamında istenen optik yoğunluğa normalize edilmiş 1 ml seri bakteri kültürü seyreltmelerini hazırlayın (bu çalışmalarda Todd-Hewitt suyu kullanılmıştır). Sayılabilir kolonilere (30-300 koloni) sahip en az bir set agar plakası üretmek için ^10-1 ila 10-6 arasında değişen seyreltmeler hazırlayın. Tüm seyreltmeleri üç nüsha halinde gerçekleştirin.
   2. Her seri seyreltmenin 100 μl'sini, analiz edilen bakteri türü için uygun ortamı içeren bir agar plakasına aktarın.
      not: Bu çalışmalarda Todd-Hewitt agar kullanıldı.
   3. 100 μl'lik alikotu agar plakasının tüm yüzeyine eşit olarak dağıtmak için bir cam veya plastik bakteri yayıcı kullanın ve sıvı agar içine emilene kadar yayılmaya devam edin. Steril bir teknik kullanarak alev altında gerçekleştirin.
   4. Agar plakalarını gece boyunca veya sayılabilir koloniler görünene kadar 37°C'de inkübe edin.
   5. Her plakada büyüyen kolonileri sayın ve orijinal kültürdeki CFU/ml'yi aşağıdaki formülle hesaplayın: koloni sayısı x mililitre cinsinden kaplanmış seri seyreltme/kültür hacminin tersi.
      örneğin (200 koloni x 1/^10-5 seyreltme) / 0.1 ml kaplama = 2.0 x 10⁸ CFU/ml

2. Konak Hücre Kültürü

1. İstenen analizler için uygun bir konak hücre hattı elde edin.
   not: Bu çalışmalar için V. Nizet'in nazik bir armağanı olan HaCaT insan epitelyal keratinositleri29 kullanılmıştır.
   1. HaCaT hücrelerini% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unda (DMEM) 100 mm'lik kültür kaplarında koruyun. 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.

3. Geçirgen Membran Ekleme Sistemi ile Konak Hücre Enfeksiyonu

1. Hücreleri uygun doku kültürü kaplarında plakalayın ve %90 birleşmeye ulaşana kadar büyümelerine izin verin.
   Not: Bu çalışmalarda kullanılan HaCaT hücreleri tipik olarak kaplamadan 2-3 gün sonra birleşime ulaşır.
   1. Lizat toplama için (örn. sinyal analizi ve adenozin trifosfat (ATP) belirleme deneyleri), HaCaT hücrelerini yaklaşık 3 x 10⁵ hücre/kuyucuk tohumlama yoğunluğunda 6 oyuklu tabakta plakalayın.
   2. İmmünofloresan görüntüleme deneyleri için, yaklaşık 3 x 10⁵ hücre/kuyucuk tohumlama yoğunluğunda 6 oyuklu çanak içinde steril cam lameller üzerindeki plaka hücreleri.
   3. Etidyum homodimer membran geçirgenliği ve laktat dehidrojenaz (LDH) salım testleri için, HaCaT hücrelerini yaklaşık 5 x 10⁴ hücre / kuyucuk tohumlama yoğunluğunda 24 oyuklu tabakta plakalayın.
2. Tedaviden hemen önce, hücreleri 1x steril PBS ile yıkayın.
3. Hücrelere taze büyüme ortamı uygulayın. Burada açıklanan koşullar için, 6 oyuklu plaka için oyuk başına 2 ml ortam veya 24 oyuklu plaka için oyuk başına 0,5 ml ortam uygulayın. Farmakolojik tedaviler test ediliyorsa, taze besiyeri ile karıştırın ve bu adımda uygulayın.
   not: Bazı tahliller alternatif besiyeri gerektirebilir. Örneğin, fenol kırmızısı ve yüksek serum konsantrasyonları LDH salınım testine müdahale ettiğinden, bu deneyler için %1 sığır serum albümini (BSA) (a/h), 2 mM L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat ile takviye edilmiş fenol kırmızısı içermeyen DMEM kullanılmıştır.
4. Taze ortam uygulandıktan sonra, her bir oyuğa dikkatlice steril bir 0,4 μm geçirgen membran eki yerleştirin. Bu adımı laminer bir akış başlığında gerçekleştirin ve geçirgen membran ekini her bir oyuğa aktarmak için steril forseps kullanın.
5. Üreticinin talimatlarına göre her bir oyuğun üst odasına taze hücre kültürü ortamı uygulayın. Burada açıklanan koşullar için, 6 oyuklu plaka için oyuk başına 1 ml ortam veya 24 oyuklu plaka için oyuk başına 0.1 ml ortam uygulayın.
6. Geçirgen membran ekleme sisteminin üst bölmesine uygun hacimde normalleştirilmiş bakteri kültürleri (bkz. bölüm 1) uygulayın. Enfekte olmamış kontrol tedavileri için bakteriyel bir ortam kullanın. Burada açıklanan sonuçlar için, 24 oyuklu plaka için oda başına 25 μl normalleştirilmiş kültür ve 6 oyuklu plaka için oda başına 100 μl kültür ekleyin.
   Not: Bu çalışmalarda, konakçı hücrelere 10 MOI'de vahşi tip veya mutant GAS uygulanmıştır. MOI, nihai ökaryotik hücre sayılarına (örneğin 2 x 10⁶ hücre / kuyucuk) dayalı olarak hesaplandı, böylece enfeksiyon döneminin başlangıcında konak hücre başına 10 kat daha fazla bakteri eklendi (ör. kuyucuk başına 2 x 10⁷ CFU). Uygun MOI, farklı bakteri türlerine ve istenen takip analizlerine göre değişecektir.
   Not: Enfekte olmamış kontroller için bakteri ortamının kullanılmasına ek olarak, bu tekniğin belirli uygulamaları için diğer yararlı kontroller, karşılaştırma için ısıyla öldürülmüş bakterileri veya kullanılmış bakteri ortamını içerebilir.
7. Enfekte olmuş hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.

4. Örnek Toplama

1. Takip analizleri için hücre kültürü ortamını, konakçı hücre lizatlarını veya bozulmamış hücrelere sahip cam lameller toplamak için, geçirgen zar ekini steril forseps ile dikkatlice çıkararak başlayın.
2. Konak hücre lizatlarının değerlendirilmesi için:
   1. Ortamı, konakçı hücrelerin tek tabakasının üzerine nazikçe aspire edin. Tek katmanı bozmaktan kaçının, çünkü bu numune kaybına neden olabilir.
   2. Hücreleri 1x PBS ile bir kez durulayın.
   3. PBS'yi nazikçe aspire edin. İstenen protein konsantrasyonunu elde etmek için hemen uygun hacimde buz gibi soğuk lizis tamponu uygulayın ve numuneleri 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. 0.5 ila 1.5 mg / ml.
      arasında protein konsantrasyonları elde etmek için her 6 oyuklu plakanın oyuğu başına 200 μl ila 350 μl arasında lizis tamponu uygulayın Not: Bu çalışmalarda kullanılan lizis tamponu, deiyonize su, %1 (h/h) Nonidet P40 Sübstitü, bir fosfataz inhibitör kokteyli ve bir proteaz inhibitör kokteylinden oluşmuştur. Belirli reaktifler, Malzemeler ve Ekipman bölümünde listelenmiştir.
   4. Hücreleri her bir oyuğun plaka yüzeyinden ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve her bir oyuğun tüm içeriğini 1,5 ml'lik bir tüpe pipetleyin.
   5. Numuneleri 14.000 rcf'de 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin.
   6. Çözünür lizat bileşenlerini değerlendirmek için, süpernatanı yeni bir tüpe çıkarın ve -20 ° C'de saklayın veya hemen kullanın.
   7. Nükleer veya diğer çözünmeyen lizat bileşenlerini değerlendirmek için peleti ayırın ve -20°C'de saklayın veya hemen kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HaCaT insan epitelyal keratinositleri			Victor Nizet'in laboratuvarından hediye.
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Yaşam Teknolojileri	11995-073	İlgilenilen hücre hattı için uygun ortamı kullanın.
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Biyobatı	S162H Serisi	İlgilenilen hücre hattı için uygun ortam katkı maddeleri kullanın.
10 cm doku kültürü kapları	Nunc (Rahibe)	150350	Diğer markalar uygundur.
6 oyuklu doku kültürü kapları	SitoOne	cc7682-7506	Diğer markalar uygundur ancak Corning kesici uç ile uyumlu olmaları gerekir.
Kollajen kaplı 0,4 μm Transwell ekleri (6 kuyulu)	Corning	3540
Kollajen kaplı 0,4 μm Transwell ekleri (24 oyuklu)	Corning	3595
Hücre sıyırıcılar	Balıkçı markası	08-100-241	Bunlar sadece hücre lizatlarının toplanması için gereklidir.
Nonidet P40 İkamesi	Sigma	74385-1L	Diğer tedarikçiler uygundur.

adet