Floresan Görüntüleme Kullanılarak Konak Hücrelere Bakteri Yapışmasının Tespiti

Abstract

Kaynak: Yang, J., et al. Konak hücrelere bakteri yapışmasının otomatik, yüksek verimli tespiti. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, floresan mikroskobu tabanlı görüntüleme kullanarak konak-patojen etkileşimlerinin dinamiklerini incelemek için epitel hücre kültürüne GFP etiketli bakteri yapışmasını değerlendirmek için bakteriyel uyum testini göstermektedir.

Protocol

1. Bakteri yapışması ve konak hücre boyaması

1. İlk olarak, tohumlanmış A549 hücre tek katmanlarını ılık 1x PBS ile üç kez yıkayın. Her yıkama için, her bir kuyucuğa 100 μL 1x PBS ekleyin, üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin, 1x PBS'yi atın veya ekledikten sonra 10 saniye bekleyin ve ardından 1x PBS'yi çıkarmak için vakumlayın. Bakteri birleşmesinin kinetiğini belirlemek için, hücreleri farklı MOI'lere (0, 1, 10 ve 100) sahip 100 μL istenen konsantrasyonlarda bakteri süspansiyonu ile kaplayın. Bakterileri 10 dakika boyunca 200 x g'da döndürün ve enfekte A549 hücrelerini 37 ° C'de,% 5 CO_2'de ek 1 saat < br / > not: Bu deneyde, her koşulun teknik bir üçlüsü vardı.
2. Tek katmanları yukarıda açıklandığı gibi ılık 1x PBS ile beş kez yıkayarak bağlanmamış bakterileri çıkarın. Hücreleri sabitlemek için 96 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 100 μL %4 formaldehit (1x PBS'de) ekleyin. Plakaları 15 dakika buz üzerinde bekletin ve ardından sabitleme solüsyonunu 1x PBS kullanarak üç kez yıkayın.
3. Çekirdeği boyamak için 50 ng / mL 4 ",6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kuyuları 1x PBS kullanarak üç kez yıkayın. Kurumayı önlemek için enfekte A549 hücrelerini 100 μL 1x PBS ile örtün. Bir sonraki adım için işlem yapın veya plakayı karanlıkta 2 güne kadar 4 °C'de saklayın.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 adet PBS	VWR (VWR)	45001-130
4 ",6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Termo Balıkçı	62248	Konak hücre boyama boyası
96 oyuklu plaka	Corning	3882	Yarım alan iyi, düz net alt
A549 hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CCL 185	Memeli hücre hattı
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5810R
OD600 DiluFotometre	IMPLEN
Tipik soya suyu	Büyüme hücreleri	MBPE-4040
F-12k orta	ATCC (Uzay Servisi)	302004	A549 hücre kültürü ortamı
Fetal sığır serumu	Corning	35-016-Özgeçmiş