Bakterilerle enfekte olmuş hücrelerde kalsiyum tepkisini incelemek için bir görüntüleme tekniği

Özet

Kaynak: Smail, Y., et al. Epitel Hücrelerinin Shigella Enfeksiyonu Sırasında Ca²⁺ Yanıtları Görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, insan epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonu üzerine lokal ve küresel kalsiyum iyonu tepkisini tespit etmek için bir tekniği göstermektedir. Shigella, konakçı hücreleri istila eder ve hücre içi kalsiyum seviyelerini etkileyen istila efektörlerini serbest bırakır. Lokal ve global sitozolik kalsiyumun genliği ve frekansı bir floresan indikatör kullanılarak incelenir.

Protokol

1. Hazırlıklar

1. Bakteri hazırlama
   1. AfaE adezinini (M90T-AfaE) ifade eden Shigella vahşi tip suşu olan bakterileri% 0.01 Kongo kırmızısı (CR) içeren bir triptikaz soya (TCS) agar plakası üzerine yerleştirin ve 37 ° C'de 18 saat inkübe edin.
      not: Tekrarlanabilirliklerini arttırmak için, adım 1.1.1'de elde edilen Shigella plakaları 4 °C'de saklanır ve bir hafta içinde kullanılmalıdır çünkü CR ortamındaki tüm koloniler zamanla kırmızıya dönecektir.
   2. Çizgi plakalarından 3 kırmızı koloni toplayarak TCS suyu ön kültürünü aşılayın.
      not: Virülans plazmidi genetik rekombinasyona uğramış tek bir klonun seçilme olasılığını sınırlamak için 3 kolonili bir aşılama yapılır.
   3. Sıvı bakteri kültürlerini çalkalanan bir inkübatörde 37 ° C'de 200 rpm'de 16 saat büyütün. 75 mg / mL'lik bir son konsantrasyonda ampisilin ekleyin. Antibiyotik konsantrasyonları, minimum inhibitör konsantrasyonun 3 katını geçmemelidir, çünkü fazla antibiyotik büyük virülans plazmidinin kaybına yol açabilir.
      not: Shigella virülans plazmidinin bakımı, bakteri kültürlerinin uygun antibiyotik konsantrasyonları ile desteklenmiş CR plakaları üzerine kaplanmasıyla doğrulanmalıdır. Beyaz kolonilerin varlığı plazmit kaybını gösterir.
   4. TCS kültürünü bakteri ön kültürü ile 1:100 seyreltmede aşılayın. 37 ° C'de, 200 rpm'de 2 saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin. 600 nm'de (OD_600nm) optik yoğunluğun 0,2 - 0,4 olduğundan emin olun.
   5. Bakteri kültürünü 21 ° C'de 13.000 x g'de 2 dakika santrifüjleyin ve peleti eşdeğer bir hacimde EM ortamında (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 5 mM glikoz ve 25 mM HEPES, pH = 7.3) yeniden süspanse edin.
   6. Bakteriyel süspansiyonu bir EM tamponunda 0.1'lik son OD_600nm'de seyreltin ve hemen kullanın veya 21 °C'de saklayın ve sonraki 60 dakika içinde kullanın.
2. Hücre hazırlığı
   1. DMEM'deki HeLa hücrelerini %10 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş 1 g/L glikoz ile kültürleyin ve bunları %10 CO₂ ile 37 ° C'de büyütün. % 10 CO 2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde% 10 FCS ve esansiyel olmayan amino asitler içeren% 10 / L glikoz ile DMEM'de yetiştirilen TC-7'yi büyütün.
   2. Hücre bakımı için, birleşik durumlara bağlı bir büyüme-temas inhibisyonunu önlemek için hücreleri düzenli olarak bölün; bu, yüksek bir Ca^{2 +} prob yükleme / transfeksiyon verimliliği için kritik öneme sahiptir.
   3. HeLa hücrelerini, HeLa hücreleri için deneyden bir gün önce 3 x 10⁵ hücre/kuyu yoğunluğunda 6 oyuklu plakalar halinde steril 25 mm çapında dairesel lameller üzerine yerleştirin.
   4. TC-7 hücreleri için, hücreleri tripsinize edin ve sayın. Onları 4 x 10⁵ hücre / kuyucukta tohumlayın ve polarizasyona izin vermek için deneylerden önce% 10 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de 5 - 7 gün inkübe edin.
      1. Deney gününe kadar hücre kültürü ortamını her gün yenileyin.
         not: Cam tabanlı 35 mm çapında tek kullanımlık hazneler, lamel içeren kuyulara alternatif olarak da kullanılabilir. İkincisi kullanılırsa, ısıtılmış bir aşama veya objektif aracılığıyla sıcaklık kontrolü yeterli değildir ve mikroskop aşamasına monte edilmiş bir termostat inkübasyon odası gereklidir.
3. Deney günü, ortamı çıkarın ve hücreleri 3x 1 mL EM ortamı ile 21 ° C'de yıkayın.
4. Hücreleri 3 mM Fluo-4/asetoksimetil ester (Fluo-4-) ile 21 ° C'de 30 dakika boyunca bir EM tamponuna yükleyin.
   not: Alt birleşen HeLa hücrelerinin yüklenmesi büyük problemlere yol açmazken, polarize TC-7 hücrelerinin yüklenmesi genellikle heterojendir ve zayıf verimlidir. Bu hücreler için, yükleme verimliliğinin, %0.1'lik bir nihai konsantrasyonda dispersiyon ajanının (pluronik asit) ve 20 μM'lik bir nihai konsantrasyonda anyon taşıyıcı inhibitör bromosulfophtaleinin Fluo-4-içeren EM'ye eklenmesiyle arttırıldığını bulduk. İkili edinim gerektiren oransal kimyasal probların veya genetik olarak kodlanmış FRET problarının kullanımı, lokal Ca²⁺ yanıtlarının görüntülenmesi için gereken edinim hızı ile uyumlu değildir.
5. Numuneleri 3 kez EM tamponu ile yıkayın ve parçasının hidrolizine izin vermek için 21 ° C'de 1 mL EM tamponunda daha fazla inkübe edin. Fluo-4 yüklü hücreleri hemen veya sonraki 90 dakika içinde kullanın (21 ° C'de tutulur).

2. Yerel Ca²⁺ Yanıtlarının Enfeksiyonu ve Görüntü Edinimi

1. Fluo-4 yüklü hücreleri içeren lamel bir görüntüleme odasına veya cam tabanlı odaya yerleştirin. Potansiyel olarak hücre lizizinden kaynaklanan bileşikleri uzaklaştırmak için numuneleri görüntüleme odasında veya cam tabanlı tek kullanımlık haznede 3x EM tamponu ile yıkayın. 1 mL EM tamponu ekleyin.
2. Odayı 33 °C'de ısıtılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu aşamasına yerleştirin.
   not: Bu sıcaklık, Shigella istila süreciyle uyumlu optimum sıcaklıklar ile yerel tepkileri görselleştirmek için Ca²⁺ tepkilerinin yavaşlaması arasında bir uzlaşma olarak seçilir. Faz kontrast halkaları ile donatılmış 63X daldırma yağı objektifi (NA = 1.25) kullanıyoruz.
3. Bir mikroskopi alanı seçin ve Fluo-4 floresan sinyalini optimize etmek için maruz kalma süresi ve gerekirse gruplama dahil olmak üzere alım parametrelerini ayarlayın.
   not: Lokal Ca²⁺ görüntülemenin en büyük zorlukları, düşük genlik ve yanıtların küçük süresidir ve en az her 30 ms'de bir edinim gerektirir. Ticari olarak temin edilebilen birkaç arkadan aydınlatmalı elektron çarpan şarj bağlantılı cihaz (EM-CCD) veya tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (C-MOS) kameralar, Fluo-4 kullanarak yerel Ca²⁺ tepkilerini tespit etmek için gerekli hassasiyeti sunar. Algılama hassasiyeti, Fluo-4'ün yüksek frekansta floresan uyarımına bağlı spontan tepkiler gibi fotohasarın veya artefaktların sınırlandırılmasında da önemli bir konudur. Burada, 470 nm'lik bir LED tabanlı aydınlatma, 480 ± 40 nm bant geçiren uyarma filtresi, 505 nm dikroik filtre ve maksimum yoğunluğunun %5'inde kullanılan 527 ± 30 nm bant geçiren emisyon ile birlikte 1.0 nötr yoğunluk filtresi ile birlikte bu sorunları en aza indirmek için sınırlı sürelerde bir kazanım akışı altında bu sorunları en aza indirmek için kullanıldı. Yerel Ca²+ sinyallerinin 120 s'lik akışlardan oluşan gruplar halinde analizi rutin olarak gerçekleştirildi. Bu düşük aydınlatma koşulları altında, 2 dakikalık akış alımları sırasında florofor foto-ağartma gözlenmedi. Farklı alanların kullanılması koşuluyla aynı numune üzerinde ardışık alımlar gerçekleştirilebilir. Genel bir kural olarak, spontan tepkilerin yokluğunu sağlamak için bakteri stimülasyonunun yokluğunda bir kontrol alanı üzerinde bir ilk edinme akışı gerçekleştirilir. Spontan yanıtlar gözlenirse, numuneler hiçbir yanıt gözlenene kadar EM tamponu ile yıkanır.
4. Numuneye bakteri eklemek için, hazneden 500 μL EM tamponunu çıkarın ve seçilen mikroskopi alanını hareket ettirmekten kaçınmak için uygun özen göstererek, 0.05'lik bir nihai OD_600nm elde etmek için adım 1.1.6'da hazırlanan 500 μL bakteri süspansiyonu ekleyin; Hacimler, bakterilerin uygun şekilde karıştırılmasını ve bakterilerin hücre numuneleri üzerinde homojen bir şekilde dağılmasını sağlar.
5. Bakteri ilavesi üzerine bir alım gerçekleştirin. Alternatif olarak, bakteri ilavesini takiben 10 dakikalık bir alım gerçekleştirin, bu da kullanılan koşullar altında bakterilerin hücrelere çökelmesi için gereken süreye karşılık gelir. Edinme akışının sonunda, hücrelerle temas eden bakterileri ve bakteri istila bölgeleriyle ilişkili zar çıkıntılarını görselleştirmek için seçilen alanın bir faz kontrast görüntüsünü elde edin.
6. Edinme prosedürünü adım 2.5'teki gibi, görüntü alımlarının süresine, dosya kaydetmeye ve tüm süreci kapsayacak şekilde yeni bir alan seçimine uygun aralıklarla tekrarlayın.
   Not: Shigella için, 10 dakikalık bakteri çökelmesini takiben 20 dakika boyunca her 5 dakikada bir edinme akışlarının, istila olaylarının çoğunu kapsamasına izin verildiğini bulduk.
7. Edinme prosedürünün sonunda, Ca 2⁺ sinyallerinin maksimum genliğini belirlemek için Ca²⁺ iyonofor iyonomisin numunelerinin 2 μM'lik bir nihai konsantrasyonunu ekleyin. Sinyal stabilizasyonuna kadar her 3 - 5 saniyede bir, genellikle 10 dakikadan daha kısa bir süre için görüntü alın.
8. Ca^{2 +} yokluğunda floresan sinyalini belirlemek için 10 mM'lik bir nihai konsantrasyonda Ca² + şelatör etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N', N'-tetraasetik asit (EGTA) ekleyerek takip edin. Sinyal stabilizasyonuna kadar her 3 - 5 saniyede bir, genellikle 10 dk.
   'den daha kısa bir sürede görüntü alın not: Küresel Ca^{2 +} varyasyonlarının nispeten yavaş dinamikleri nedeniyle, bu alımları her 3 - 5 saniyede bir (akış modunda değil) gerçekleştirin ve ardışık tedaviler sırasında aynı mikroskobik alanda Ca^{2 +} görüntülemeye izin verin.

3. Analiz

1. Zaman içinde ΔF/F0 yüzdesi olarak sitozolik Ca²⁺ varyasyonlarını ifade edin, burada ΔF, ilgilenilen bölgenin (ROI) ortalama floresan yoğunluğunun değişimini ve F0, aynı ROI'deki temel floresan varyasyonunu temsil eder, bu da hücrelerden yoksun alanın ilgisiz bir bölgesi çıkarılır.
   1. Taban çizgisine karşılık gelen farklı alanlardaki her hücre için bazal floresan seviyelerini çıkarın; bu seviyeler, belirli bir akış edinimindeki yerel Ca^{2 +} yanıtlarının düşük frekansı ve nispeten kısa süresi nedeniyle açık bir şekilde belirlenebilir.
      Not: Sorulan sorular ve incelenen patojenik modelle ilgili yanıtların çarpıcı özelliklerini nicelleştirin. Klasik olarak, Ca²⁺ sinyallerini analiz etmek için yerel veya küresel Ca²⁺ yanıtları gösteren hücrelerin frekansı ve bu yanıtların süresi, genliği ve sıklığı dahil olmak üzere çeşitli parametreler dikkate alınır. Shigella ve yerel tepkiler söz konusu olduğunda, analizin bir diğer önemli yönü, yanıtların bakteri istila bölgeleriyle mekansal ilişkisidir.
2. Küresel veya yerel tepkiler gösteren duyarlı hücrelerin yüzdesini ölçmek için, Fluo-4 yoğunluğunun varyasyonlarına karşılık gelen zaman serilerinde hücrelerdeki ROI'leri çizin.
   1. Yanlış bir pozitif puanlamayı önlemek için, ortalama floresan yoğunluğu hücre taban çizgisinin arka plan varyasyonlarının üç kat üzerinde bir genlik veya en az 200 ms'lik bir süre gibi yerel Ca²⁰⁰⁺ yanıtlarını tanımlamak için katı parametreler ayarlayın.
      not: Genel bir kural olarak, küçük yerel Ca²⁺ yanıtları bile profillerine göre herhangi bir arka plan gürültüsünden ayırt edilebilir. ROI'ler, yerel varyasyonların algılanmasına izin vermek için yeterli floresan sinyalini entegre edecek kadar büyük olmalıdır. Fluo-4 tespitinin yoğunluğuna bağlı olarak, bu ROI'ler çapları 2 - 5 mM arasında değişen dairelere karşılık gelebilir.
   2. Yanıtların yerel mi yoksa küresel mi olduğunu belirlemek için aynı hücrenin farklı bir bölgesindeki 2 bölgedeki ortalama Fluo-4 floresan yoğunluğunun değişimlerini ölçün.
      not: Çok sayıda hücrenin analizi, seçilen bölgeler için zaman içinde ortalama floresan yoğunluğunun değişimlerinin çevrimiçi olarak görüntülenmesine izin veren görüntüleme yazılımının kullanılmasıyla kolaylaştırılır. Ticari olarak temin edilebilen görüntüleme yazılımının böyle bir seçeneği vardır, ancak bu, ROI Intensity Evolution eklentisi kullanılarak Icy ücretsiz yazılımı kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
   3. Yerel yanıtları gösteren hücrelerin yüzdesini belirleyin.
      not: Bu yüzde, mikroskopi alanında analiz edilen toplam hücre sayısından hesaplanır ve bu, parametrik olmayan bir test kullanılarak istatistiksel bir anlamlılığı desteklemek için yeterli sayıda olmalıdır.
   4. Yerel yanıtların süresini belirleyin.
      not: Yerel Ca²⁺ yanıtları, süre aralıklarına (yani 500 ms'den az, 5 ila 10 saniye arasında veya 10 saniyenin üzerinde) ve Shigella istila bölgeleriyle ilişkilerine göre daha fazla ayırt edilebilir.
3. Yanıtların genliğini ölçün. İlk olarak, adım 2.1.7'de belirlenen maksimum Ca²⁺ ve hücre arka plan seviyelerini kalibre edin. Fluo-4 yükü her hücre için değişebileceğinden, bu belirlemeleri sahadaki tek tek hücreler için gerçekleştirin.
   1. Yanıtların genliğini, maksimum yanıtın göreli bir yüzdesi olarak ifade edin.
   2. Bir normallik testi kullanarak istatistiksel test yapın, ardından örnekler arasındaki yanıtların genliğindeki potansiyel farklılıkları analiz etmek için parametrik bir test yapın.
   3. Bu tepkilerin bakteri istila bölgelerine göre ilişkisini, ilgili faz kontrast görüntülerinde görselleştirilen bakteri kaynaklı membran fırfırlarına ilişkin lokalizasyonlarına göre belirleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fluo-4	Canlandırıcı	F14201
Metamorf sürüm 7.7	Evrensel Görüntüleme
CoolLED aydınlatma sistemi pE-2	Roper Bilimsel
Mikro çanak 35 mm, yüksek	AYNI ŞEY	81156
Triptikaz Soya (TCS) suyu	Termo Balıkçı	B11768
TCS agar	Termo Balıkçı	B11043
Kongo kırmızısı	Sigma-Aldrich	75768
M90T-AFAE	Güneş ve ark. 2017		Shigella flexneri serotip V. AfaE adezinini ifade eder
İPM-AFA	Güneş ve ark. 2017		AfaE adezinini eksprese eden izojenik ipgD mutant suşu