Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Pan-lökositlerin hazırlanması
- Heparinize bir şırıngada sağlıklı bir donörden (veya hastadan) 1 mL periferik kan alın. Kan bağışı için sorumlu etik kurul onayı aldığınızdan emin olunuz.
- 1 mL insan periferik kanını 30 mL ACK lizis tamponu (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3 ve 0.1 mM EDTA, pH 7.0) ile 50 mL'lik bir tüpte karıştırın ve oda sıcaklığında 8 dakika inkübe edin.
- Tüpleri PBS ile doldurun ve 6 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 30 mL ACK lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
- Süpernatant temizlenene kadar 1.2 ve 1.3 adımlarını tekrarlayın. Son olarak, hücreleri PBS'de yıkayın, oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve hücre peletini 2 mL kültür ortamında (RPMI1640 +% 10 FCS) yeniden süspanse edin. Hücreleri 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
2. Raji Hücrelerinin SEB ile Yüklenmesi
- Tüp başına 1.5 x 106 Raji hücresi olan iki adet 15 mL Falcon tüpü hazırlayın. Hücreleri döndürün (oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 300 x g) ve süpernatanı atın.
- Hücreleri artık ortamda (yaklaşık 50-100 μL) yeniden süspanse edin, 1.9 μL (1.9 μG) SEB ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 5 mL kültür ortamı ekleyin, hücreleri döndürün (oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 300 x g) ve peleti kültür ortamında (RPMI1640 +% 10FCS) 1 x 10 6 hücre / mL yoğunlukta yeniden süspanse edin.
3. İmmün Sinapsların İndüksiyonu ve Boyama Protokolü
- SEB yüklü Raji hücrelerinin hazırlanmasının 500 μL'sini bir FACS tüpüne ve yüksüz Raji hücrelerinin preparatının 500 μL'sini başka bir FACS tüpüne pipetleyin. Her tüpe 650 μL pan-lökosit ekleyin ve hücreleri döndürün (oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g). Süpernatanı atın ve peleti 150 μL kültür ortamında (RPMI1640 +% 10 FCS) yeniden süspanse edin. 37 °C'de inkübe edin (tipik olarak 45 dakika).
- Hücreleri nazikçe girdaplayın (1.000 rpm'de 10 sn) ve hücreleri sabitlemek için girdap sırasında 1,5 mL paraformaldehit (%1,5) ekleyin. 1 mL PBS +% 1 BSA ekleyerek fiksasyonu durdurun. Hücreleri pelet (oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra hücre peletini 1 mL PBS +% 1 BSA içinde yeniden süspanse edin.
- Pelet (oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g) ve hücrelere nüfuz etmek için hücreleri 100 μL PBS +% 1 BSA +% 0.1 saponin içinde oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yeniden süspanse edin (96 oyuklu plaka, U şeklinde).
- Hücreleri PBS +% 1 BSA +% 0.1 saponin içinde santrifüjleme ile yıkayın (oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g) ve hücre peletini 50 μL PBS +% 1 BSA +% 0.1 saponin içeren florofor etiketli antikorlar veya bileşikler (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) ve DAPI (1:3,000)).
- Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 1 mL PBS +% 1 BSA +% 0.1 saponin ekleyerek hücreleri 3 kez yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Görüntüleme akış sitometrisi için hücreleri 60 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
4. Akış Sitometresi Kullanarak Görüntü Alma
>NOT: Aşağıdaki görüntü elde etme prosedürü ve veri analizi, imagestream (IS100), INSPIRE ve IDEAS gibi yazılımlar kullanılarak görüntüleme akışı sitometrisine dayanmaktadır. Bununla birlikte, diğer akış sitometreleri ve analiz yazılımları da kullanılabilir.
- Görüntüleme akış sitometresine bağlı bilgisayarda analiz yazılımını açın ve Cihaz menüsünde Fluidics'i Başlat'a tıklayın. İstendiğinde boncukları doğru bağlantı noktasına uygulayın.
- Dosya menüsünden varsayılan şablonu yükleyin ve Çalıştır/Kurulum'a tıklayın. Görünüm açılır menüsünden Boncuklar'ı seçin.
- Belirtilen değer 200'ün altındaysa Yoğunluğu Ayarla'ya tıklayarak parlak alan aydınlatıcısını ayarlayın.
- Tümünü Başlat'a tıklayarak Assist sekmesindeki kalibrasyon ve test rutinini çalıştırın.
- Flush/Lock/Load'a tıklayın ve istendiğinde numuneleri sol bağlantı noktasına uygulayın. Hücreleri akış sitometresine yükledikten sonra, Hücre Sınıflandırıcıyı açın ve değerleri aşağıdaki gibi ayarlayın: her kanal için 1.022'de tepe yoğunluk üst sınırı, kanal 50 (DAPI) ve kanal 2 (CD5-Pe-TxR) için 5'de tepe yoğunluk alt sınırı, kanal 1 (yan saçılma) için 50'de alan alt sınırı ve 1.500'de üst sınır.
- Kurulum sekmesinde uyarma lazer gücünü 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) ve 647 nm (90 mW) olarak değiştirin.
- Hücre sınıflandırıcıyı ve lazer gücü ayarlarını değerlendirmek için Hücreler ve Boncuklar arasındaki Görünüm açılır menüsünü değiştirin.
not: Hücre sınıflandırıcılarını ve/veya uyarma lazer güçlerini değiştirerek tüm hücrelerin ve hücre çiftlerinin Hücre Görünümü'nde bulunduğundan ve hücre kümelerinin, döküntülerin ve doygun pikselli görüntülerin Enkaz Görünümü'nde bulunduğundan emin olun.
- Kurulum sekmesinde örnek adını ve alınacak görüntü sayısını (örnekler için 15.000–25.000 ve telafi denetimleri için 500) tanımlayın. Alımı başlatmak için Çalıştır/Kurulum'a tıklayın.
