>NOT: Tüm besiyeri hazırlama ve hücre kültürü teknikleri, laminer akışlı bir biyogüvenlik kabini kullanılarak aseptik koşullar altında gerçekleştirilir. Açıklanan tüm kültür inkübasyon adımları, 37 °C, %5CO2 ve %95 nem atmosferini korumak için tasarlanmış bir inkübatör kullanılarak gerçekleştirilir.
1. Hücre kültürü
- Büyüme ortamının hazırlanması
- MSC (mezenkimal kök hücreler) ve LADMAC (fare kemik iliği türevi makrofajlar; hücre hattını oluşturan araştırmacıların isimlerinden türetilmiştir: Laskin, Dower ve Malech) için, 50 mL FBS ve 5 mL 100x antibiyotik/antimikotik karışımı 500 mL yüksek glukozlu DMEM'e (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı) ekleyin.
- Makrofajlar (MΦ) için, 50 mL FBS, 100 mL LADMAC koşul ortamı (bölüm 1.2'deki adımlar izlenerek hazırlanır) ve 500 mL yüksek glukoz DMEM'e 5 mL 100x antibiyotik karışımı ekleyin.
not: LADMAC hücreleri, MΦ hücrelerinin büyümesini desteklemek için gerekli olan koloni uyarıcı faktörü (BOS-1) üretir.
- Ko-kültür için hazırlık olarak hücreleri çoğaltın
- Dondurulmuş stoktan MSC ve MΦ hücrelerini tohumlamak için, her hücre tipi için dört adet 100 mm'lik hücre kültürü muameleli kapların her birinde bölüm 1.1'de hazırlanan 9 mL uygun büyüme ortamını dengeleyin ve 15 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- Bu arada, 106 donmuş hücrenin alikotlarını 37 ° C'lik bir su banyosunda 2-3 dakika veya sadece çözülene kadar inkübe ederek hızlı bir şekilde çözün. Daha sonra, çözülmüş MSC hücrelerini 9 mL taze MSC büyüme ortamına ekleyin ve çözülmüş MΦ hücrelerini 15 veya 50 mL steril konik tüplerde 9 mL taze MΦ büyüme ortamına ekleyin ve sallanan bir kova rotorunda 125 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin veya boşaltın ve her peleti uygun taze büyüme ortamının 4 mL'sinde hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Adım 1.2.1'de dengelenen her hücre tipi için dört adet 100 mm'lik çanağın her birine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
- Hücreli bulaşıkları inkübatöre geri koyun. Ortamı %70-80 birleşene kadar her 2-3 günde bir değiştirin.
2. Deneysel yemeklerde MSC tohumu, 1. Gün
NOT: MSC'yi tohumlamadan önce, floresan spektrofotometri için deneysel 96 oyuklu plaka düzenini ve dinamik görüntüleme için hazne slaytını tasarlayın. 96 oyuklu plaka için, deney kuyularını hücre içeren kuyucuklarla çevreleyin, ancak bunları tahlilde kullanmayın. Reaktif boşluğu (RBL) için kullanılacak en az dört kuyucuğu işaretleyin. Örnek 96 kuyucuklu şablon için Tablo 1'e ve 4 oyuklu oda slayt şablonu örneği için Tablo 2'ye bakın. Şeffaf tabanlı siyah veya beyaz 96 oyuklu plakalar önerilir. 1,5 mm'lik bir borosilikat cam hazne sürgüsü en uygunudur, ancak oda sayısı çalışma tasarımına bağlı olarak ayarlanabilir. Takip eden yöntemlerin bir özet akış şeması Şekil 1'de yer almaktadır.
- % 70 -% 80 birleşmede, 100 mm'lik tabaklardaki kültürlerden büyüme ortamını aspire edin ve MSC'yi izole etmek için 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
- PBS'yi aspire edin, 2 mL% 0.05 tripsin / EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) ekleyin ve 3-5 dakika kültür inkübatörüne koyun.
- 3 dakika sonra, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücre dekolmanı kontrol edin. Hücreler ayrılırsa, bir sonraki adıma geçin; Değilse, 1-2 dakika daha inkübasyona devam edin. 5-6 dakikadan daha uzun süre kuluçkaya yatırmayın.
- Ayrılmış hücrelerle birlikte yemeğe 5 mL taze büyüme ortamı ekleyin. Tripsin / orta karışımını kullanarak kabı durulayın ve hücreleri steril bir serolojik pipet kullanarak temiz, steril 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
- 125 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 10 mL taze büyüme ortamında hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
- Hücreleri saymak için, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 30 μL% 0.4 tripan mavisi çözeltisine 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Daha sonra, karışımın 10 μL'sini bir hemositometre sayma odasının lamel altına pipetleyin.
- Ters çevrilmiş veya parlak alan mikroskobu kullanarak, 10x objektifle, 1 mm'lik2 karenin dördündeki lekelenmemiş (canlı) hücreleri sayın. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre numarasını hesaplayın: hücreler/mL = hücre sayısı/# 1 mm2 kareler x seyreltme faktörü x 104.
not: Bu örnek için, sayılan 1 mm2 karenin sayısı dörttür ve seyreltme faktörü 4'tür.
- 1 x 105 hücre/mL süspansiyonu hesaplamak ve hazırlamak için C1V1 = C2V2 denklemini kullanın. Plaka tasarımına göre doldurulacak 96 oyuklu plakanın her sütunu için 1 mL hücre / mL süspansiyon ve doldurulacak 4 oyuklu odacıklı kızağın her odası için 0,75 mL hazırlayın.
not: C1 = hücre sayısı, V1 = hesaplanan, C2 = 1 x 105, V2 = 5.50 mL.
- V1'i belirleyin ve süspansiyonu hazırlamak için gereken taze ortamın hacmini belirlemek için toplam hacmin istenen 5.50 mL'sinden çıkarın. Orijinal süspansiyondan gelen hücrelerin hacmini (V1) 1 x 105 hücre / mL ile toplam 5.50 mL için taze ortam hacmine ekleyin.
- Çok kanallı bir mikro pipetleyici kullanılarak plaka tasarımına göre 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 μL1 x 10 5 hücre/mL süspansiyon ve plaka tasarımına göre bir mikropipet kullanarak hazne slaytının her bir oyuğuna 530 μL ekleyin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
not: Bu deney için, MSC'ler 96 oyuklu plakanın 1, 2, 3 ve 6 numaralı sütunlarında (Tablo 1) ve 4 oyuklu oda slaytının 1 ve 2 numaralı kuyularında (Tablo 2) kaplanır. Bu nedenle, 1 x 105 hücre / mL'lik bir süspansiyonun en az 5.50 mL'si hazırlanır. % 80 birleşmede MΦ, MSC'lerin deney plakalarına ekildiği gün enflamatuar mediatörlerle tedavi edilir.
3. MΦ'yi izole edin ve ko-kültürleri hazırlayın, 2. Gün
- Aktivasyon ortamını MΦ hücrelerinden çıkarın ve 5 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin. Bir hücre kaldırıcı ile nazikçe kazıyın ve hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
- MSC için adım 2.6-2.7'de açıklandığı gibi tripan mavisi dışlama ve hemositometri kullanarak hücreleri sayın.
- Adım 2.8-2.9'daki denklemi kullanarak, biri kontrolden hücreler ve diğeri tedavi edilen MΦ kültürlerinden hücreler olmak üzere 2 x 105 hücre / mL'lik iki ayrı süspansiyon hazırlayın.
not: Plaka tasarımına göre doldurulacak 96 oyuklu plakanın her sütunu için 1 mL hücre / mL süspansiyon ve doldurulacak 4 oyuklu odacıklı kızağın her odası için 0,75 mL süspansiyon hazırlayın.
- Ortamı, MSC içeren 96 oyuklu plakanın deney kuyularından nazikçe aspire edin. Çok kanallı bir mikropipet kullanarak, plaka tasarımına göre MSC'li ve MSC'siz uygun deney kuyucuklarına 100 μL muamele edilmiş ve kontrol MΦ hücre süspansiyonları ekleyin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
- Ortamı MSC içeren 4 oyuklu hazneli sürgüden nazikçe aspire edin ve bir mikropipet kullanarak, tasarıma göre uygun oyuklara 530 μL MΦ hücre süspansiyonu ekleyin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
4. Fagositoz testi, kinetik floresan 96 oyuklu plaka okuması, 3. Gün
- Tahlil parametrelerini ayarlayın
- Tahlil gününde, floresan plaka okuyucuyu açın ve sistemdeki sıcaklığı bilgisayarda 37 °C'ye ayarlayın.
- System Pro yazılımını açın ve cihazın bilgisayara bağlı olup olmadığını belirlemek için sol üst köşedeki cihaz simgesini kontrol edin. Çizgili kırmızı daire görünüyorsa, enstrüman simgesine tıklayın ve bağlantıyı yapmak için açılır pencerede enstrümanı seçin.
- Plaka Kurulum Yardımcısı açılır penceresine erişmek için Yeni Deney'i seçin. Plaka Kurulum Yardımcısı menüsünden, Edinme Ayarlarınızı Yapılandırın'ı seçin.
- Optik konfigürasyon için ayarlar menüsünden Monokromatörü seçin. Okuma modu için FL (floresan) ve okuma türü için Kinetik'i seçin.
- Aynı yapılandırmalar penceresinde, Kategori altında, Dalga Boyları'na tıklayın ve ardından bant genişliklerini uyarma için 9 nm ve emisyon için 15 nm olarak ayarlayın.
- Dalga boyu çiftlerinin sayısını 1 olarak ayarlayın. LM1 dalga boylarını uyarma için 510 nm'ye ve emisyon için 540 nm'ye ayarlayın.
- Kategoriler arasında devam edin ve ardından Plaka Tipi'ni seçin. Kullanılan plaka tipine uygun seçeneği seçin.
not: Seçimin plaka tipine uygun olması önemlidir. Okuma yükseklikleri seçime göre sistem tarafından ayarlanır.
- Ardından, Okuma Alanı'nı seçin ve deneysel tasarıma dahil edilen 96 oyuklu plakanın alanını vurgulayın.
- PMT ve Optik'i seçin, PMT Kazancını Yüksek olarak ve okuma başına Yanıp Sönmeyi 6 olarak ayarlayın. Şeffaf tabanlı bir plaka kullanıyorsanız Alttan Oku'nun yanındaki kutuyu işaretleyin.
- Zamanlama'yı seçin ve 70 dakikalık bir süre boyunca 10 dakikalık aralıklarla ayarlayın.
- Salla'yı seçin, İlk Okumadan Önce kutusunu işaretleyin ve 5 saniye olarak ayarlayın. Okumalar Arası kutusunu işaretleyin ve 3 saniye boyunca ayarlayın. Sarsıntı yoğunluğunu hem Düşük hem de Doğrusal olarak ayarlayın.
- Pencereyi kapatın. Plaka Kurulum Yardımcısı penceresi açıldığında, Plaka Düzeninizi Yapılandırın öğesini seçin. Plaka tasarımının BL kuyularını vurgulayın ve Plaka Boş'a tıklayın.
- Deneysel satırların her birini vurgulayın, Ekle'ye tıklayın, gruba bir ad verin ve ardından bir renk seçin.
- Plaka tasarımının altındaki Atama Seçenekleri altında, Seri'yi seçin ve ardından pencerede seriyi tanımlayın ve Tamam'a tıklayın. Her grup için tekrarlayın.
- Zymosan süspansiyonunu hazırlayın
- Sistem sıcaklığının 37 °C'ye ulaşmasını beklerken, canlı hücre görüntüleme ortamının 5 mL'sinde 1 mg zimozan partikülünü yeniden süspanse edin.
- Partikülleri içeren şişeye 1 mL canlı hücre görüntüleme ortamı ekleyin ve bunları bir cam kültür tüpünde toplayın. Şişeyi ek 1 mL görüntüleme solüsyonu ile durulayın ve tüm partiküllerin aktarıldığından emin olmak için aynı cam tüpe aktarın. 0.2 mg / mL partikül süspansiyonu elde etmek için 3 mL ek görüntüleme solüsyonu ekleyin.
- 30-60 s boyunca hızlı darbeli girdap. Ardından, 60 hızlı darbeyle sonikasyon yapmak için bir prob sonikatörü kullanın.
not: Homojen bir partikül süspansiyonu oluşturmak ve deney kuyucuklarına eklemeden önce süspansiyonun çok uzun süre oturmasına izin vermemek çok önemlidir. Topaklanma hızla tekrarlar. Hücre yoğunluğu başına partikülün, kullanılan MΦ'nin kaynağına, işlemine ve yoğunluğuna bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir. Sunulan çalışmalarda konjuge zimozan parçacıkları kullanılmıştır. Bununla birlikte, konjuge E. coli ve S. aureus da mevcuttur.
- Zymosan ekleyin ve plakayı okuyun
- Besiyerini deney kuyucuklarından aspire edin ve 1x'i 100 μL canlı hücre görüntüleme solüsyonu ile durulayın. RBL kuyularını canlı hücre görüntüleme solüsyonu ile de durulayın.
- Canlı hücre görüntüleme solüsyonunu deneysel ve RBL kuyularından aspire edin ve 100 μL zimozan partikül süspansiyonu ile değiştirin.
- Dokunmatik yüzey arayüzünü kullanarak floresan okuyucunun plaka tepsisini açın. Plakayı, kapaksız olarak, A1 kuyusu sol üst köşede olacak şekilde tepsiye yerleştirin. Dokunmatik yüzeyi kullanarak tepsiyi kapatın ve üst menüdeki yeşil Oku düğmesine tıklayın.
- Okuma tamamlandığında, dosyayı uygun klasöre kaydedin ve Dosya'ya tıklayıp Dışa Aktar'ı seçerek verileri bir elektronik tablo biçiminde dışa aktarın.
- Elektronik tablodaki (Ek Dosya 1) her bir zaman noktasında (10 dakika, 20 dakika, 30 dakika vb.) her çoğaltma grubu için ortalama ± SEM bağıl floresansını hesaplayın ve verileri grafik yazılımına aktarın.
- Verileri sunmak için bir çizgi grafik formatı kullanın ve bireysel gruplar arasındaki farkları belirlemek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testini takip eden iki yönlü ANOVA (Faktör olarak Zaman x Tedavi/MSC) uygulayın.
not: 96 oyuklu plaka okuması devam ederken, dinamik görüntüleme plakasını zaman atlamalı görüntü elde etmek için hazırlayın. Dinamik görüntülemenin her seferinde bir deney kuyusunun analiziyle ilerlediğinden emin olun.
Tablo 1: 96 oyuklu plaka tasarımı örneği. CBL - Boş hücre; MSC - seribaşı 1. gün; MΦ + tedavi edilmiş ve MΦ muamele edilmemiş tohumlanmış 2. gün; RBL reaktifi boş, test 3. günde eklendi.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Bir | CBL (ÖİK) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (ÖİK) | RBL (Türkçe) |
| B | CBL (ÖİK) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (ÖİK) | RBL (Türkçe) |
| Ç | CBL (ÖİK) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (ÖİK) | RBL (Türkçe) |
| D | CBL (ÖİK) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (ÖİK) | RBL (Türkçe) |
| E | CBL (ÖİK) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (ÖİK) | RBL (Türkçe) |
| F | CBL (ÖİK) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (ÖİK) | RBL (Türkçe) |
| G | CBL (ÖİK) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (ÖİK) | RBL (Türkçe) |
| H | CBL (ÖİK) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (ÖİK) | RBL (Türkçe) |
Tablo 2: 4 kuyulu odacıklı slayt tasarımı örneği. MSC - kaplamalı gün 1; MΦ + tedavi edilmiş ve MΦ tedavi edilmemiş kaplama 2. gün.
