Bakteriyel Efektör Proteinlerin Elektroporasyon ile Memeli Hücrelerine Sokulması

Özet

Kaynak: Sontag, R. L. et al., Fonksiyonel Bakteriyel Efektörlerin Memeli Hücrelerine Elektroporasyonu. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, bakteriyel efektör proteinlerin elektroporasyon yoluyla memeli hücrelerine girişini gösteriyoruz. Bakteriyel efektör proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, spesifik florofor konjuge antikorlarla boyamayı takiben konfokal mikroskopi ile tespit edilir.

Protokol

1. Elektroporasyon

1. Önceden soğutulmuş bir küvete 400 μl hücre süspansiyonu yerleştirin ve küvete 20 μg seçilmiş protein ekleyin (50 μg/ml).
2. Hücrelere zarar vermeden karıştırmak için küveti hafifçe ~ 10 kez hafifçe vurun. not: Küvet ayrıca iyice karıştırmak için birkaç kez ters çevrilebilir, ancak hücrelere zarar vermemek için yukarı ve aşağı pipetleme veya girdap yapmayın.
3. Elektroporatörde elektrik arkını önlemek için küvetin dışını bir kağıt havlu veya başka bir silecek ile kurulayın.
4. Numuneyi 0.3 kV'da 1.5-1.7 msn boyunca elektromat. Not: Bu, bu çalışma için tipikti.
5. Elektroporasyondan hemen sonra, iyice karıştırmak için küveti hafifçe ~ 10 kez hafifçe vurun.

2. Hücrelerin Kaplanması

1. Elektrikli hücreli küveti, geri kazanım plakalarına yerleştirilmeye hazır olana kadar buz üzerinde saklayın.
2. Çoğu aşağı akış analizi için, yabancı efektör proteini uzaklaştırmak için hücreleri 1x önceden ısıtılmış NGM ile yıkayın.
   1. Analiz için hücreleri çıkarın ve 3-5 ml NGM'de askıya alın.
   2. 4 dakika boyunca 900 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri.
   3. İstenen plaka boyutu için yeterli miktarda NGM'de yeniden süspanse edin (örneğin, 35 mm'lik bir tabak için 2 ml).
3. Aşağı akış analizi için uygun miktarda hücreyi çıkarın.
   1. Örnek 1: Mikroskopi analizi için cam tabanlı tabaklara yerleştirin.
   2. Örnek 2: Afinite saflaştırmaları gibi protein analizi için hücre kültürü plastiğine plaka.
4. Hücrelerin en az 4 saat boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş% 95 hava ve/% 5 CO₂ atmosferinde dengelenmiş plakalarda iyileşmesine izin verin.

3. Mikroskopi Analizi

1. Fiksasyon / İmmünofloresan Boyama
   1. 4 saatlik bir iyileşme süresinden sonra hücreleri 1 kez steril PBS ile yıkayın.
   2. Hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika boyunca% 100 metanol içinde sabitleyin. Hücreleri tamamen kaplayacak kadar metanol kullanın (örneğin, 35 mm'lik tabak için 2 ml).
   3. 3x'i steril PBS ile yıkayın.
   4. PBS'de% 0.4 Triton X-100 ile hücreleri 15 dakika boyunca geçirgenleştirin. Örneğin, 35 mm çapında bir plaka için 1 ml kullanın.
      1. Triton X-100'ün geçirgenlik uzunluğunu ve gücünü, hedef proteinin epitopuna ve konumuna göre ayarlayın. not: En iyi sonuçların her hedef için ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir, ancak yukarıdaki koşullar çoğu sitozolik hedef için yeterli olmalıdır.
   5. RT'de 1 saat boyunca PBS'de% 5 Sığır Serum Albümini (BSA) ile bloklayın. Örneğin, 35 mm çapında bir plaka için 1 ml kullanın.
   6. 3x'i PBS ile yıkayın.
   7. Birincil antikoru antikor bağlama çözeltisinde (PBS'de %0.1 Triton X-100 ve %1 BSA) gece boyunca 4 ° C'de hafifçe sallayarak inkübe edin. Örneğin, 35 mm çapında bir plaka için 0,5 ml kullanın.
      1. Antikor seyreltmesi için üreticinin tavsiyelerine uyun. not: Örneğin, streptavidin bağlayıcı peptit etiketi (SBP-tag) antikoru 1: 1.000 seyreltmede kullanılırken, PKN1 antikoru 1: 200 seyreltmede kullanıldı.
   8. PBS ile 4 kez yıkayın.
   9. Antikor bağlama çözeltisi içinde uygun floresan konjuge ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca ışıktan korunarak inkübe edin.
      1. Örneğin, Alexa 488 veya Alexa 647'yi oda sıcaklığında 1 saat boyunca kullanın.
         1. Antikor seyreltmesi için üreticinin tavsiyelerine uyun. (örneğin, bu çalışma için yaklaşık 1: 1.000).
      2. Gerektiği gibi başka lekeler ekleyin, örneğin, oda sıcaklığında 1 saat boyunca üreticinin tavsiyesine göre Alexa 647 veya DAPI ile konjuge edilmiş 5 μM Buğday tohumu aglütinini (WGA).
   10. PBS ile 5 kez yıkayın ve 4 °C'de, görüntüye hazır olana kadar ışıktan koruyarak saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTA Çözeltisi	Hücre Kanalı	25-050-CL
0,4 cm Boşluklu tek kullanımlık elektroporasyon küvetleri	Biyo-Rad	165-2088
%100 Metanol	herhangi	Yok	Yanıcı, Toksik
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Hücre Sayma Aparatı - Hemositometre veya Coulter Sayacı	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	Modeli: Z1
Hücre Kültürü İnkübatörü	herhangi	Yok	37 °C'de nemlendirilmiş %95 hava/%5 CO2 atmosferi
Hücre Kültürü Plastik	herhangi	Yok	Hücre kültürü şişeleri/plakaları, pipetler, tüpler, kauçuk polis
Dulbecco'nun Eagle's Medium (DMEM) Modifikasyonu	Hücre Kanalı	10-013	37 °C'ye kadar sıcak
Elektroporatör	Biyo-Rad	E. coli Pulser
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Hücre Kanalı	35-016-Özgeçmiş
Floresan konfokal mikroskop	Ziess (Türkçe)	Modeli: LSM 710
Mikroskopi için cam tabanlı tabaklar	Wilco Kuyuları	HBSt-3522
HeLa Hücre Hattı	ATCC (Uzay Servisi)	ATCC CCL-2
Minimal Temel Orta (MEM)	Hücre Kanalı	10-010	37 °C'ye kadar sıcak
Solma önleyici reaktif ile birlikte diğer floresan lekeler (WGA, DAPI)	herhangi	Yok
Penisilin / Streptomisin	Hücre Kanalı	30-002-CL
RAW 264.7 Hücre hattı	ATCC (Uzay Servisi)	TİB-71
İlgilenilen hedefe karşı birincil antikor	herhangi	Yok
Florofora konjuge edilmiş ikincil antikor	herhangi	Yok
Fosfat Tamponlu Tuzlu	herhangi	Yok	4 °C'ye soğutun
Steril Fosfat Tamponlu Salin	herhangi	Yok	37 °C'ye kadar sıcak
Konik Tüpleri Kabul Edebilen Masa Üstü Santrifüj (sallanan kova tercih edilir)	herhangi	Yok
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Tahriş edici, toksik