Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Malassezia'nın laboratuvar koşullarında yetiştirilmesi
>NOT: Bu protokol için kullanılan tüm reaktifleri ve ortamları, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında (RT, 20 – 25 °C) saklayın, çünkü düşük sıcaklık mantar büyümesini engelleyebilir.
- Malassezia büyümesi için sıvı modifiyeli Dixon (mDixon) ortamını hazırlayın. 500 mL sıvı mDixon ortamı hazırlamak için, 18 g Malt özütü, 10 g kurutulmuş Ox-safra, 5 mL Tween-40, 3 g Peptone, 1 mL Gliserol ve 1 mL Oleik Asidi 500 mL damıtılmış H2O (dH2O) içinde çözün. Ortamı HCl ve otoklav ile pH 6'ya ayarlayın. Ortamı RT'de saklayın.
- Otoklavlamadan önce 500 mL mDixon ortamına 7,5 g agar ekleyerek mDixon agar plakalarını hazırlayın. Soğutma sırasında ortamın kısmen katılaşmasını önlemek için bir direksiyon çubuğu ve manyetik bir ısıtma plakası kullanarak otoklavlamadan sonra mDixon agarını yavaşça soğutun.
- Agar 50 – 60 °C'ye kadar soğuduktan sonra, sıvıyı laminer bir akış başlığında Petri kaplarına dağıtın ve gece boyunca RT'de kurumaya bırakın.
not: Agar plakaları, buharlaşmayı önlemek için sarıldığında ve baş aşağı tutulduğunda birkaç hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.
- Malassezia izolatlarını elde edin ve sağlayıcı tarafından alınan talimatlara göre Malassezia'nın liyofilize stoklarını canlandırın.
- Sağlayıcı tarafından alınan talimatlara göre steril 100 mL Erlenmeyer şişesine 10 mL sıvı mDixon ortamını yeniden canlandırılan Malassezia süspansiyonu ile aşılayın. Kültürü 30 ° C ve 180 rpm'de çalkalayan bir inkübatörde inkübe edin.
- Krem renginin ve bulanıklığın görünümünü kontrol ederek Malassezia kültürünün büyümesini düzenli olarak inceleyin. Büyüme kinetiği, Malassezia'nın türüne ve türüne bağlıdır ve Malassezia liyofilize bir stoktan taze olarak canlandırıldığında özellikle yavaş olabilir. (Şekil 1A).
- Yoğun olarak yetiştirilen Malassezia kültürünün 3 parçasını mDixon ortamında 1 parça steril% 99 gliserol ile karıştırarak gliserol stoklarını hazırlayın. Malassezia/gliserol karışımını steril vidalı tüplere alın ve -80 °C'de saklayın.
- İn vitro çoğaltma için, mDixon'daki sıvı kültürden veya donmuş gliserol stoğundan Malassezia'yı bir aşılama döngüsü kullanarak bir mDixon agar plakasına (4 ° C'den RT'ye getirilir) plakalayın.
not: mDixon agar plakalarını kullanımdan önce 4 °C'den RT'ye aktarın, çünkü soğuk mDixon agar mantar büyümesini engeller.
- Akar plaka(lar)ını Malassezia ile baş aşağı aN (sallamayan) inkübatörde 30 °C'de inkübe edin. Malassezia kolonilerinin büyümesini düzenli olarak inceleyin.
NOT: mDixon agar plakaları üzerindeki Malassezia kolonileri 3-5 gün içinde ortaya çıkar ve krem renginde donuk, dışbükey yükselmeli pürüzsüzdür (Şekil 1B).
- Malassezia kolonilerini mDixon agar plakalarında RT'de ~ 2 hafta saklayın. Daha sonra, 1.7'de tarif edildiği gibi donmuş gliserol stoğundan Malassezia'yı çizerek yeni bir mDixon agar plakası hazırlayın.
2. Farelerin deneysel Malassezia enfeksiyonu için aşının hazırlanması
- Bir mDixon agar plakasından 3-5 ayrı Malassezia kolonisi ile steril bir 100 mL Erlenmeyer şişesinde 10 mL sıvı mDixon ortamını aşılayın (bkz. adım 1, Şekil 1B).
- Malassezia kültürünü 30 °C ve 180 rpm'de ~ 48 ila 96 saat, kültür krem rengi ve bulanık olana kadar inkübe edin (Şekil 1A).
not: Malassezia'nın büyümesi için gereken süre, Malassezia türüne ve suşuna ve aşılama için kullanılan mantar miktarına bağlıdır.
- 2 mL Malassezia kültürünü steril 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti 1 mL fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) içinde süspanse ederek yıkayın. 10.000 x g'da 1 dakika tekrar santrifüjleyin.
- Yıkamadan sonra, peleti kuvvetli pipetleme ile 1 mL PBS'de süspanse edin ve çözeltinin optik yoğunluğunu bir spektrometre kullanarak 600 nm'de (ODA600) ölçün. Okumanın 20 ile 50 ile 0.1 br / > arasında olduğundan emin olmak için OD ölçümü için Malassezia süspansiyonunu 1.< x PBS ile seyreltin
not: 3 günlük bir Malassezia kültürünün yoğunluğu, Malassezia türüne ve suşuna ve kültürün aşılanması için kullanılan maya hücrelerinin sayısına bağlı olarak genellikle 15 ila 30 ODA600 arasında değişir (adım 2.1). Malassezia agrega oluşturma eğilimindedir, bu nedenle süspansiyonun homojenliğini sağlamak için kuvvetli pipetleme gereklidir.
- PBS'de 4 ODA600 yoğunluğa karşılık gelen Malassezia süspansiyonunun bir hacmini steril 2 mL'lik bir tüpe alikot edin. Enfekte olacak hayvan başına 1 tüp hazırlayın.
- Malassezia içeren tüpleri 10.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve Malassezia peletini 200 μL doğal zeytinyağında (2 ODA600 maya hücresi / 100 μl zeytinyağına karşılık gelir) süspanse edin.
not: Malassezia lipofilik ve lipid bağımlı bir maya olduğundan, zeytinyağının Malassezia ile epikütan enfeksiyon için iyi bir araç olduğu bulundu. Zeytinyağı cilt tarafından PBS'den daha iyi emilir. Ancak, Malassezia'yı zeytinyağında askıya almanın kolay olmadığını unutmayın. Malassezia/zeytinyağı süspansiyonunu girdap yaparak iyileştirin. Enfeksiyon için kullanılana kadar süspansiyonu RT'de tutun.
- Kontrol hayvanlarının sahte enfeksiyonu için sadece zeytinyağı ile tüpler hazırlayın.
3. Fareleri Malassezia ile enfekte etmek
- Dişi C57BL / 6 fareleri 6 - 8 haftalıkken sipariş edin ve deney hayvanı tesisinde en az bir hafta boyunca iklimlendirmelerine izin verin. Enfekte olmamış bir kontrol grubu da dahil olmak üzere grup başına 3 - 5 fare için hesaplayın.
- PBS'de 1.3 mg / mL Ksilazin ve 6.5 mg / mL Ketamin içeren steril bir anestezik kokteyl hazırlayın. 5 mL anestezik kokteyl 20 hayvanı uyuşturmak için yeterlidir. Kokteylin hacmini anestezi uygulanacak hayvan sayısına göre ayarlayın.
- Vücut ağırlığına 10 μL/g anestezik kokteyl intraperitoneal olarak enjekte ederek hayvanları uyuşturun (vücut ağırlığının kg'ı başına 65 mg Ketamin ve 13 mg Ksilazin'e karşılık gelir) ve anestezi uygulanmış hayvanları 37 °C'de bir ısıtma yastığına yerleştirin.
not: Belirtilen dozda, hayvanlar genellikle ~ 30 - 60 dakika boyunca anestezi altında kalır.
- Hayvanların tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için arka ayağı forseps ile sıkıştırarak refleksleri kontrol edin.
- Anestezi sırasında dehidrasyonu önlemek için gözlere bir göz kremi uygulayın.
- İsteğe bağlı olarak, bir kumpas (0 - 5 mm aralığında) kullanarak her iki kulağın kulak kalınlığını ölçün. Her kulağın iki farklı bölgesini ölçün ve kulak başına ortalama kulak kalınlığını hesaplayın.
not: Kulak kalınlığının ölçülmesi isteğe bağlıdır ve araştırma sorusuna bağlıdır. Bununla birlikte, kulak kalınlığı cilt iltihabı için bir okuma olarak kullanılıyorsa, enfeksiyondan önce temel kulak kalınlığını ölçmek gerekir. (bkz. Adım 4).
- İsteğe bağlı olarak, hafif bant sıyırma ile dorsal kulak derisinin epidermal bariyerini bozun: cilde manuel olarak küçük bir bant parçası uygulayın ve tekrar çıkarın. Her tur için yeni bir bant parçası kullanarak art arda 5 tur tekrarlayın.
NOT: Malassezia, bariyeri bozulmuş ciltte, bozulmamış cilde kıyasla daha belirgin bir cilt iltihabına neden olur (Şekil 2A).
- Steril bir pipet kullanarak her bir kulağın sırt tarafına topikal olarak 100 μL (2 ODA600) Malassezia / zeytinyağı süspansiyonu uygulayın. Sadece zeytinyağı ile muamele edilen hayvanlardan oluşan bir kontrol grubunu dahil edin (araçla muamele edilen kontrol grubu).
not: Uygulamadan hemen önce homojen bir Malassezia süspansiyonu sağlamak için Malassezia/zeytinyağı süspansiyonunu kuvvetlice vorteksleyin.
- Anestezi uygulanmış hayvanları, iyileşme belirtileri gösterene kadar (bıyık hareketi, artan solunum hızı vb.) hipotermiyi önlemek için ısıtma yastığının üzerinde bırakın.
- Metabolizmalarını ve rehidrasyonlarını desteklemek için 200 μL steril ve önceden ısıtılmış% 2 glikoz çözeltisini deri altına ense kıvrımına enjekte edin.
not: Steril% 2'lik bir glikoz çözeltisi hazırlamak için, 1 mg glikozu 50 mL PBS'de çözün ve 0.2 μm'lik bir filtre kullanarak süzün. Çözelti 4 °C'de saklanabilir.
- Hayvanları kafeslerine geri transfer edin.
4. Malassezia'nın neden olduğu cilt iltihabının analizi
NOT: Bu prosedür, cilt iltihabının bir parametresi olarak hizmet eden enfeksiyon sırasında Malassezia'nın neden olduğu kulak şişmesinin analizini açıklar. Mantarın neden olduğu kulak şişmesini analiz etmek için bir ön koşul, bant sıyırma ve/veya enfeksiyondan önce temel kulak kalınlığının ölçülmesidir (Adım 3.5).
- Malassezia ile enfekte olmuş ve kontrol hayvanlarının kısa süreli anestezisi için izofluran odası hazırlayın.
Her - seferinde bir hayvanı odaya aktarın ve hayvanın tamamen uyuşturulmasını bekleyin.
not: Uygun anestezi belirtileri arasında tam vücut gevşemesinin yanı sıra yavaş ve ağır (yan) nefes alma yer alır. İzoflurana uzun süre maruz kalmak ölümcül olabileceğinden anesteziyi dikkatlice izleyin.
- Hayvanı hazneden çıkarın ve bir mendilin üzerine yerleştirin.
- Bir kumpas (aralık 0 - 5 mm) kullanarak kulakların kalınlığını ölçün. Her kulağın iki farklı bölgesini ölçün ve kulak başına ortalama kalınlığı hesaplayın (bkz. adım 3.5).
- Hayvanı kafese geri aktarın.
not: İzofluran anestezisi çok kısa ömürlüdür ve hayvanlar izofluran odasından çıkarıldıktan sonra ~ 30 saniye içinde iyileşir.
- Bant sıyırma ve/veya enfeksiyondan önce ölçülen ortalama başlangıç kulak kalınlığını, enfeksiyondan sonraki her zaman noktasında ölçülen ortalama kulak kalınlığından çıkararak kulak kalınlığındaki artışı hesaplayın.
- Hesaplanan değerleri, kulak kalınlığındaki artış veya alternatif olarak, her bir hayvan veya hayvan grubu için zaman içindeki toplam kulak kalınlığı olarak çizin (Şekil 2B).
5. Enfekte ciltte mantar yükünün analizi
- Alınacak her kulak için dH 2O'da 0,5 mL steril% 0,05 nonidet P40 (NP40) ve otoklavlanmış bir çelik bilye (5 mm çapında) içeren steril bir 2 mLmikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
- Tüpleri hassas bir terazi kullanarak tartın ve kesin ağırlığı not edin.
- Fareleri CO2 asfiksiasyonu ile ötenazi yapın.
- Tabandaki kulakları çıkarın ve adım 5.1 - 5.2'de açıklandığı gibi dH2O'da 0,5 mL steril% 0,05 NP40 içeren tüpe aktarın.
- Kulak dokusunu içeren tüpü tartın ve organın bulunduğu tüpün ağırlığından organsız tüpün ağırlığını çıkararak her numunenin gerçek ağırlığını hesaplayın.
- Bir doku homojenizatörü kullanarak kulak dokusunu 25 Hz'de 6 dakika homojenize edin. Dokunun iyi homojenize edildiğinden emin olun.
- Her numuneden 100 μL'lik plaka (her homojenatın 1/5'ine karşılık gelir, seyreltme faktörü = 5) mDixon agar plakalarına yerleştirin ve plakaları 30°C'lik bir inkübatörde baş aşağı inkübe edin.
not: Homojenat kaplama miktarı, beklenecek mantar yüküne göre ayarlanmalıdır. Kolay sayım sağlamak için plaka başına en az 10 ve en fazla 250 koloni elde etmek için yeterli homojenat plakaladığınızdan emin olun. İsteğe bağlı olarak, numune başına farklı homojenat seyreltmelerine sahip birden fazla plaka plakalayın.
- Malassezia kolonilerinin büyümesini düzenli olarak inceleyin.
not: Koloniler genellikle 2-3 gün sonra görünür hale gelir. Malassezia kolonilerinin büyümesi için gereken süre, Malassezia'nın türüne ve türüne bağlıdır.
- Plaka başına kolonileri sayın.
- Aşağıdaki formülü kullanarak koloni oluşturan birimlerin sayısını, CFU/g dokusunu hesaplayın:
CFU/g doku = (koloni/plaka sayısı) x (seyreltme faktörü) / (cilt örneğinin g cinsinden ağırlığı).
not: Yaklaşık minimum tespit limiti aşağıdaki formül kullanılarak değerlendirilebilir: minimum tespit limiti = (1 koloni / plaka) x (seyreltme faktörü) / (g cinsinden tüm cilt örneklerinin ortalama ağırlığı).
- Mantar yükleri genellikle logaritmik bir ölçekte çizilir (Şekil 2C).
