$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Monosit türevi hücrelerin Mtb enfeksiyonu
>NOT: Aşağıdaki adımlar bir BSL-3 tesisinde gerçekleştirilmelidir.
- Mycobacterium tuberculosis (Mtb) peletini serum içermeyen RPMI ortamında yeni bir steril 50 mL tüpte yeniden süspanse edin ve nihai bakteri konsantrasyonunu yaklaşık 5 x 106 CFU / mL'ye ayarlayın.
- Hücre kültürü ortamını, monositten türetilmiş hücreleri içeren 6 oyuklu plakadan (plakalardan) çıkarın. Her kuyucuğa 1 mL serumsuz RPMI ortamı ekleyin. Çok sayıda enfeksiyon (MOI) 5: 1 elde etmek için kuyucuk başına 1 mL bakteri süspansiyonu ekleyin, yani 2 mL / kuyucukta 10 6 makrofaj başına 5 x10 6 CFU ve plakaları 37 ° C'de 4 saat inkübe edin ve% 5 CO2.
- Enfeksiyondan sonra, hücre dışı bakterileri uzaklaştırmak için hücreleri 1 mL steril yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın. Plakayı eğin ve tüm yıkama tamponunu köşelerden dikkatlice çıkarın. Mtb ile enfekte olmuş monosit türevli hücreleri antibiyotiksiz 2 mL RPMI tam ortamında yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi boyamaya devam edin veya akış sitometrisinden önce hücreleri 24 saat (veya diğer zaman noktaları) için inkübe edin.