Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Fare Kaynağı ve Muhafazası
- Daha önce tarif edildiği gibi bir C57BL / 6J genetik arka plan üzerinde fareler (Lysozyme M (LysM) promotör bölgesine yerleştirilen gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP)) türetin. LysM-EGFP farelerini MyD88-/- (Miyeloid farklılaşması birincil yanıt 88 proteini) ile bir C57BL / 6J arka plan üzerinde geçerek LysM-EGFP×MyD6J farelerini türetin.
- Bir vivaryumda ev fareleri. Bu çalışmalar için, hayvanlar ameliyattan önce Kaliforniya Üniversitesi, Davis'te gruplar halinde barındırıldı ve ameliyattan sonra tek tek barındırıldı. 10-16 haftalık yaşlar arasında fareler kullanın.
2. Bakteri Hazırlama ve Miktar Tayini
- İlgilenilen biyolüminesan Staphylococcus aureus türünü -80 ° C'lik depolamadan buz üzerinde çözdürmek için çıkarın. % 5 sığır kanlı agar plakasına sürün. Çizgili plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca (16 saat) 37 °C'de inkübe edin.
not: Bu protokolde ALC2906 SH1000 suşu kullanılmıştır. Bu suş, Photohabdus luminescens'ten luxABCDE raportör kasetine kaynaşmış penisilin bağlayıcı protein 2 promotörü ile mekik plazmidi pSK236'yı içerir.
- mL saf su başına 0.03 g TSB tozu karıştırarak triptik soya suyu (TSB) hazırlayın ve sterilize etmek için TSB'yi otoklavlayın. Soğuduğunda, steril bir teknik kullanarak gerekli antibiyotikleri ekleyin. Bu protokolde, biyolüminesans luxABCDE kasetini içeren pSK236 mekik plazmidinin ekspresyonunu seçmek için TSB'ye 10 μg/mL kloramfenikol ekleyin.
- Bir gece boyunca kültüre başlamak için S. aureus plakasından 3-4 ayrı koloniyi 10 μg / mL kloramfenikol ile TSB'ye alın. Bakterileri gece boyunca (16 saat) 37 ° C'de inkübe eden bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- Bir numuneyi 1:50 oranında 10 μg/mL kloramfenikol ile TSB'ye seyrelterek gece boyunca kültürden yeni bir bakteri kültürü başlatın. 200 rpm ve 37 °C'de inkübe edici bir çalkalayıcıda kültür.
- S. aureus'u böldükten iki saat sonra, bir spektrofotometrede 600 nm'de (OD600) optik yoğunluğu izleyin. Orta logaritmik faz büyümesini bulmak için OD600'ü zamana karşı gözlemleyin. ALC2906 SH1000 suşu için, 0.5'lik bir OD600 orta logaritmiktir ve 1 x 108 CFU/mL'lik bir konsantrasyona karşılık gelir (CFU = koloni oluşturan birim) (Şekil 1).
- OD600 0.5 olduğunda, bakterileri 1: 1 oranında buz gibi Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile yıkayın. Bakterileri 3.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve ek soğutulmuş DPBS ekleyin ve iyice girdap yapın. 3.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika daha santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice boşaltın. Bakteri peletini istenen konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Bu çalışmalar için, 3 mL ALC2906 SH1000 toplayın ve yaklaşık 2 x 108 CFU / mL'lik bir bakteri konsantrasyonuna karşılık gelen 1.5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin. Bakterileri kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Bakteri konsantrasyonunu doğrulamak için, bakteri örneğinin 100 μL'sini PBS'de 1:10.000 ve 1:100.000 oranında seyreltin. Bir agar plakası üzerinde 20 μL alikot plakası. 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 16 saat inkübe edin. Brüt muayene ile CFU'ları sayın ve ertesi gün bir bakteri konsantrasyonu hesaplayın.
3. Eksizyonel Deri Yarası ve S. aureus ile Aşılama
- İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla her fareye 100 μL 0.03 mg / mL buprenorfin hidroklorür (~ 0.2 mg / kg) uygulayın.
- Enjeksiyondan yirmi dakika sonra,% 2-4 izofluran içeren 2-3 LPM oksijen içeren bir odaya 2-4 fareyi yerleştirin. Fareler tamamen anestezi altına alındıktan sonra, fareleri birer birer% 2-4 izofluran ile 2-3 LPM oksijene bağlı bir burun konisine aktarın. Her bir arka pençeyi başparmak ve işaret parmağı arasında sıkıca sıkıştırarak farelerin tamamen uyuşturulduğunu doğrulayın. Hayvan çimdiklemeye cevap vermezse bir sonraki adıma geçin.
- Farenin arkasındaki 1 inç'e 2 inçlik bir bölümü elektrikli kesme makineleriyle tıraş edin ve temiz bir mendil veya gazlı bez kullanarak kürk kırpıntılarını temizleyin. Tüy dökücü losyon kullanmaktan kaçının çünkü aşırı iltihaplanmaya neden olabilir.
- Farenin arkasını önce %10 povidon-iyot ile ıslatılmış gazlı bez ve ardından %70 etanol ile ıslatılmış gazlı bez ile temizleyin. Alanı, cerrahi alanın merkezinden dışa doğru hareket ederek spiral bir düzende temizleyin. Ameliyattan önce cerrahi bölgenin kuruması için yaklaşık 1 dakika bekleyin.
- Farenin traşlı sırtını iki parmağınız arasında gevşek bir şekilde tutun ve hazırlanan cerrahi alanın ortasına 6 mm'lik steril bir punch biyopsisine sıkıca bastırın. Cildi gergin bir şekilde çekmeyin.
- Zımba biyopsisini, cilt üzerinde, taslağın en az bir bölümünde cildi tamamen kesen dairesel bir taslak oluşturmak için bükün. Alttaki fasyayı veya dokuyu kesmemeye dikkat edin.
- Punch biyopsisi tarafından basılan dairesel deseni takip ederek epidermis ve dermisi kesmek için steril makas ve forseps kullanın.
4. S. aureus Aşılama
- 28 G'lik bir insülin şırıngasını istenen biyolüminesan bakteri aşılayıcı ile doldurun. Bu çalışmada, 1 x 108 CFU / mL (50 μL) konsantrasyon uygulayın. 100 μL'den fazla hacim uygulamayın.
- Farenin arkasındaki yaranın ortasındaki fasya ile doku arasına 50 μL aşılayıcı enjekte edin. Aşılayıcının, minimum sızıntı veya dağılma ile yaranın merkezinde bir kabarcık oluşturduğundan emin olun.
- Dermisi yana doğru çekin, şırıngayı dokuya neredeyse paralel tutun ve şırıngayı, fasyanın delindiğini gösteren dirençte ani bir azalma hissedilene kadar yavaşça dokuya itin. Şırıngayı dikkatlice yaranın ortasına yönlendirin ve aşılayıcıyı yavaşça dağıtın. Şırıngayı hayvandan yavaşça çıkarın.
- Yukarıda tarif edildiği gibi enfekte olmamış hayvanların yaralarına aynı hacimde steril PBS enjekte edin.
- Hayvanı kafesine geri koyun. Kafesi bir ısı lambasının altına veya bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve anesteziden iyileşene kadar hayvanı izleyin.
>5. İn Vivo biyolüminesans görüntüleme (BLI) ve floresan görüntüleme (FLI)
- Cihaz yazılımı aracılığıyla tüm hayvan görüntüleyiciyi başlatın. % 2-4 izofluran ile 2-3 LPM oksijen alan bir odada fareleri uyuşturun. Görüntüleyicinin içindeki burun konilerine anestezi verin.
- Yaralı ve enfekte olmuş fareyi görüntüleyiciye yerleştirin. Fareyi, yara mümkün olduğunca düz olacak şekilde konumlandırın. Fareleri görüntülemek için aşağıdaki sıra kurulumunu kullanın.
- Görüntüleme modu olarak Lüminesans ve Fotoğraf'ı seçin. Pozlama süresi küçük gruplamada 1 dakikadır ve F/stop 1 (lüminesans) ve F/stop 8'dir (fotoğraf). Emisyon filtresi açık. Görüntüyü kaydetmek için Elde Et düğmesine tıklayın.
- Görüntüleme modu olarak Floresan ve Fotoğraf'ı seçin. Pozlama süresi, küçük gruplamada 1 s ve 465/30 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve yüksek lamba yoğunluğuna sahip 520/20 nm'lik bir emisyon dalga boyuna sahip F/stop 1 (Floresan) ve F/stop 8'dir (fotoğraf). Görüntüyü kaydetmek için Elde Et düğmesine tıklayın.
- Hayvanı kafesine geri koyun ve anesteziden kurtulana kadar izleyin.
- Yukarıda açıklandığı gibi günlük olarak fareleri görüntüleyin.
