Vitronektinin konakçı epitel hücrelerine bakteri yapışmasındaki rolünü incelemek için bir test

Özet

Kaynak: Singh, B. ve ark., Vitronektinin Bakteriyel Yapışma ve Serum Direncindeki Rolünü İncelemek İçin Deneyler. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, Haemophilus influenzae'nin konak epitel hücrelerine yapışmasında vitronektinin rolünü incelemek için bir test gösteriyoruz.

Protokol

1. Bakterilerin epitel hücrelerine Vn'ye bağlı yapışmasının incelenmesi

1. %10 (hacim/hacim), fetal buzağı serumu (FCS) (tam ortam) ve 5 μg/mL gentamisin ile desteklenmiş, F12 besiyeri olan 75^cm2'lik bir doku kültürü şişesinde A549 hücrelerinin (tip II alveolar epitel hücreleri) kültürü. Şişeyi% 5 CO₂ içeren bir inkübatörde 3 gün boyunca 3 ° C'de% 80 birleşene kadar inkübe edin (birleşme, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak hücrelerin yüzey kaplamasını görselleştirerek tahmin edilebilir). Aşağıdaki dört adım, epitel hücrelerinin tahlil için nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır.
   1. Şişedeki hücre tek tabakasını 20 mL PBS ile hafifçe döndürerek iki kez yıkayın. Hücreleri şişe yüzeyinden ayırmak için 2 mL hücre ayırma enzim çözeltisi ekleyin ve şişeyi 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Tüm hücreleri plastik yüzeyden ayırmak için şişeye avucunuzla hafifçe vurun. Hücre kümelerini dağıtmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
   2. Şişeye 18 mL F12 tam ortam ekleyin ve tüm hücre süspansiyonunu 50 mL'lik steril bir Falcon tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu RT'de 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini 10 mL F12 tam ortamda yeniden süspanse edin.
   3. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini çıkarın ve bir Eppendorf tüpüne yerleştirin, ardından 90 μL Tripan mavisi çözeltisi ekleyin. Lameli yerleştirdikten sonra numuneyi bir hemositometreye (derinlik 0,1 mm) yükleyin.
   4. A, B, C ve D alanlarındaki tüm canlı hücreleri sayın (her alan 16 kareden oluşur ve her karenin alanı 0,0025^mm2'dir), ardından ortalama hücre sayısını hesaplayın ([A+B+C+D]/4). Aşağıdaki denklemi kullanarak mililitre başına hücre sayısını hesaplayın:
      Canlı hücreler/mL = ortalama hücre sayısı ×^{10 4 ×} seyreltme faktörü.
      not: Burada seyreltme faktörü 10'dur.
   5. 5 μg/mL gentamisin içeren tam bir ortam kullanarak hücre süspansiyonunu 5.0 x 10³ hücre / mL'ye seyreltin. 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna 500 μL hücre süspansiyonu dağıtın. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO₂ içinde% 90 hücreler birleşene kadar inkübe edin.
2. Bakteriyel enfeksiyondan önce, ortamı kuyucuklardan çıkarın ve F12 ortamı (FCS olmadan) ekleyin, ardından gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. Hücre tek tabakasını RT'de 500 μL PBS ile üç kez yıkayın. Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve 10 μg / mL Vn içeren 100 μL önceden soğutulmuş F12 ortamı ekleyin. Plakayı 4 ° C'de 1 saat inkübe edin. Kontrol kuyuları için sadece F12 ortamı ekleyin.
4. İnkübasyondan sonra, çözeltiyi pipetleyerek atın ve hücre tabakasını RT'de 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
5. Kültür: Hif klinik izolatları, 10 μg/mL NAD ve hemin ile desteklenmiş 10 μg/mL NAD ve hemin ile desteklenmiş, 200 rpm'de çalkalanarak. E. coli'yi kültürlemek için Luria-Bertani ortamını kullanın. Hif'i orta log fazında (OD600 = 0.3) hasat edin ve bakterileri fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.2 içinde yeniden süspanse edin,% 1 (a / h) sığır serum albümini (BSA) (bloke edici tampon; PBS-BSA) olarak adlandırılır. Süspansiyonu 10⁹ CFU/mL'ye ayarlayın. F12 ortamında (2×10⁸ CFU / mL) taze yetiştirilmiş Hif M10 kültürünü yeniden askıya alın. Her bir oyuğa bu bakteri süspansiyonundan 100 μL ekleyin ve plakayı 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
   not: Her kuyucuk yaklaşık 2 x 10⁵ A549 hücresi içerir. Enfeksiyon için, 100'lük bir enfeksiyon çokluğuna karşılık gelen 2 x^{10 7} bakteriyel CFU eklendi.
6. Pipetleme yoluyla ortamı çıkarın ve A549 epitel hücrelerini PBS ile üç kez yıkayın. 50 μL / kuyucuk hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
7. Daha sonra, enzimatik reaksiyonu durdurmak için oyuk başına 50 μL F12 tam ortam ekleyin. Epitel hücrelerini (≈100 μL [yani tüm hacim]) her oyuktan dört cam boncuk içeren 6 mL'lik bir cam tüpe aktarın. Hücreleri 2 dakika boyunca girdaplayarak RT'de parçalayın.
8. 990 μL F12 ortamına 10 μL lizat ekleyerek 10 μL hücre lizatını 100 kat seyreltin. Seyreltilmiş numunenin 10 μL'sini bir çikolata agar plakası üzerine koyun.
9. Çikolatalı agar plakasını gece boyunca 37 °C'de inkübe edin, ardından kolonileri sayın. Her koloni bir CFU'yu temsil eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp	BD Şahin	60819-138	12 × 75 mm stili
% 5 CO2 sağlanan inkübatör	Termo Bilimsel	BBD6220
6 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp	VWR (VWR)	89000-478	12 × 75 mm stil kapaklı
24 oyuklu plakalar	BD Şahin	08-772-1H	Hücre kültürü sınıfı
75cm2 doku kültürü şişesi	BD Şahin	BD353136	Bacalı
A549 Hücre Hattı insan	Sigma-Aldrich	86012804-1VL
Hücre ayrılma enzimi (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-500ML	Hücre Kültürü Sınıfı
Sığır Serum Albüminleri (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Hücre kültürü için uygun
F12 orta	Sigma-Aldrich	D6421	Hücre Kültürü Sınıfı
Fetal Baldır Serumu (FCS)	Sigma-Aldrich	12003C	Hücre kültürü için uygun
Hemositometre	Marienfeld	640210
Doku kültürü şişesi	BD Şahin	3175167	75 cm2
İnsan plazmasından vitronektin (Vn)	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Hücre kültürü sınıfı

arası Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Belediyesi Gazetesi