Yöntem makalesi

İnsan serumunun bakterisidal aktivitesine karşı bakteriyel dirençte vitronektinin rolünün belirlenmesi

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Singh, B. ve ark., Vitronektinin Bakteriyel Yapışma ve Serum Direncindeki Rolünü İncelemek İçin Deneyler.J. Vis. Uzm.(2018)

Bu video, bir insan serum glikoproteini olan vitronektinin bakteri direnci üzerindeki rolünü göstermektedir. Serumdaki antikorlar, bakteriyel yüzey proteinleri ile etkileşime girerek kompleman proteinlerini aktive eder ve membran saldırı kompleksini oluşturarak bakteriyel hücre lizisine neden olur. Bakteri zar proteini üzerindeki vitronektin bağlanması, zar saldırı kompleksi oluşumunu önleyerek bakteri sağkalımı ile sonuçlanır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

>1. İnsan Serumunun Bakterisidal Aktivitesine Vn'ye Bağlı Direncin Analizi

  1. Ticari bir kaynaktan normal insan serumu (NHS) satın alın. Vitronektin veya Vn tükenmiş serum (VDS) hazırlayın. VDS'yi, NHS'de bulunan Vn'ye eşdeğer olan 180 nM Vn ile doldurun.
  2. Kompleman proteinlerini inaktive etmek için NHS'yi 56 °C'de 30 dakika ısıtarak ısıyla inaktive edilmiş serum (HIS) hazırlayın.
    not: Test için optimal serum konsantrasyonu (% 5) ve inkübasyon süresi (15 dakika) Haemophilus influenzae tip f (Hif) için ampirik olarak belirlendi; Bu parametreler diğer bakteriyel patojenler için değişebilir.
  3. Kültür bakterileri (bu durumda, Hif M10 ve mutant Hif M10Δlph) orta log fazına (OD600 = 0.3). 10 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüjleme ile pelet bakterileri.
  4. Bakteri peletini %2,5 (a/h) glikoz, 2 mM magnezyum klorür, MgCl2, 0,15 mM kalsiyum klorür, CaCl2 ve %0,1 (ağırlıkça/hacim) jelatin içeren 1 hacim dekstroz jelatin Veronal tamponu (DGVB ++; pH 7.3) ile yeniden süspanse edin.
  5. % 5 serum (NHS, HIS, VDS veya VDS + 180 nM Vn) içeren 100 μL DGVB ++ 'ya 1,5 x10 3 koloni oluşturan birim (CFU) bakteri ekleyin. Numuneyi 37 °C'de 300 rpm'de çalkalayarak 15 dakika inkübe edin.
  6. 0 dakika (T0 numune) ve 15 dakika (T t numune) reaksiyon karışımından 10 μL'lik bir alikot çıkarın ve çikolatalı agar üzerine tabağı koyun. Plakayı gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  7. Kuluçka işleminden sonra, plakada görünen kolonileri sayın. Aşağıdaki denklemi kullanarak öldürülen bakteri yüzdesini hesaplayın: (koloni oluşturan birim veya Tt'de CFU)/(T0'da CFU) × 100.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp VWR (VWR)89000-47812 × 75 mm stil kapaklı
Normal insan serumu (NHS)Tamamlayıcı Teknoloji, Inc.NhsHavuzlanmış insan serumu
Kalsiyum klorür (CaCl2)Sigma-AldrichC5670-500G
glikozSigma-AldrichG8270-1KG
jelatinSigma-AldrichG9391Hücre kültürü için uygun
HemositometreMarienfeld640210
Magnezyum klorür (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-1KG
İnsan plazmasından vitronektin (Vn)Sigma-AldrichV8379-50UGHücre kültürü sınıfı
Shaker Stuart BilimselSTR6 SerisiPlatform çalkalayıcı
arası Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Belediyesi Gazetesi Serisi Gazetesi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Membran Atak KompleksiKompleman AktivasyonuSerum Bakterisidal AktivitesiBakteriyel Sa kal mCFU Analiziikolata Agar nk basyonuDGVB Tamponu

İlgili makaleler