Ex Vivo Koşullarda HIV Patogenezini İncelemek için Bir İnsan Servikal Mukoza Enfeksiyonu Modeli

Özet

Kaynak: Introini, A., et al., İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü 1 ve Histokültür ile İnsan Lenfoid Dokusu ve Kadın Genital Mukozasının Ex Vivo Enfeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, insan rahim mukozal dokusunun insan immün yetmezlik virüsü tip 1, HIV-1 ile ex vivo enfeksiyonunu ve bunların hava-sıvı arayüzünde jelatin süngerlerin üzerinde bakımını göstermektedir. Bu yöntem, insan dokularında HIV-1 replikasyonunun ve patogenezinin izlenmesine izin verir.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Uterin Servikal Mukozanın Diseksiyonu ve Enfeksiyonu

>NOT: En iyi sonuçlar için, servikal mukoza eksplantları ameliyattan sonra mümkün olan en kısa sürede, ideal olarak ameliyatın aynı gününde işlenmeli ve enfekte edilmelidir. Alternatif olarak, örnekler gece boyunca 4 ° C'de CMT'ye (antibiyotiklerle desteklenmiş Kültür Ortamı) daldırılabilir ve diseksiyondan hemen sonra enfekte edilebilir.

1. CM'nin RT'ye ulaşması için yeterli zaman tanıyın veya 37 ° C'de önceden ısıtılmış bir su banyosuna koyun. Kullanmadan önce CM'yi antibiyotik solüsyonu (CMT) ile destekleyin. Kalan antibiyotik solüsyonunu atın. Diseksiyon prosedürü sırasında gerektiğinde forseps ve neşteri ıslatmak için% 70 etanol çözeltisini temiz bir kaba dökün. Aletleri temizleyin ve birden fazla donörden alınan örneklerin diseksiyonları arasında neşter bıçağını değiştirin.
2. Steril forseps kullanarak, numuneyi taşıma kabından 10-20 mL CMT içeren 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
3. Dokuyu incelemek için Petri kabının kapağını kesme yüzeyi olarak kullanın. Dokuyu forseps ile nazikçe tutarak, ektoserviks ve/veya endoserviks mukozasını alttaki stromal ve kas dokusundan (submukoza) bir neşter ve bıçakla ayırın ve mukoza şeritleri elde edin.
   not: Tek bir doku parçası üzerinde çalışırken, doku kurumasını önlemek için dokunun geri kalanını bir ortama batırılmış halde tutmak önemlidir.
4. Mukozayı 2 mm genişliğinde şeritler halinde kesin ve mümkün olduğunca fazla submukozayı çıkarın ve atın, geriye sadece 2 mm kalınlığında bir doku tabakası bırakın. Şeritleri 2 mm kalınlığında bloklar halinde kesin. Bu, kabaca 8 mm³.
   doku eksplantları ile sonuçlanmalıdır Dikkat: İnsan örneklerini incelemek için keskin aletlerin kullanılması yaralanma ve kontaminasyon riskini artırır. Operatör, ek koruma olarak metal, file ve kesilmeye dayanıklı eldivenler giymeyi düşünmelidir.
5. Diseksiyona devam ederken doku kurumasını önlemek için doku eksplantlarını 10-20 mL CMT içeren 100 mm'lik yeni bir Petri kabına aktarın. Diseksiyonun sonunda, eksplant dağılımını randomize etmek için plakayı döndürün.
6. Steril forsepslerle, eksplantları steril 1.5 mL konik tüp(ler)e aktarın (tüp başına maksimum 16 eksplant). Bir pipet kullanarak tüpteki herhangi bir ortamı çıkarın.
7. HIV-1 preparatını 37 ° C'de bir su banyosunda çözdürün. Gerekirse, virüs stoğunu CM ile seyreltin. Virüsü, eksplantları içeren tüp(ler)e aktarın. Artık virüs preparatını atın.
   not: Virüs stoğu, seçilen inokulum en az 0.5 mL'lik bir hacimde bulunacak şekilde seyreltilmelidir (Tablo 1). Bağımsız deneyler arasındaki sonuç değişkenliğini azaltmak için, tüm çalışma için aynı virüs preparatı kullanılmalıdır (Materyal Tablosu).
8. Tüpleri bir termo-çalkalayıcıya aktarın ve 37 ° C'de 2 saat inkübe edin ve 300 rpm'de sallayın. Tüpleri her 30-60 dakikada bir birkaç kez nazikçe ters çevirin
   Not: Etkili bir enfeksiyon için, HIV-1 preparatının çözülmesi ile tüplerin 37 ° C'ye aktarılması arasında gereken minimum süreyi kullanmak çok önemlidir.
9. 6 oyuklu bir plakayı, steril fosfat tampon salin (PBS) kuyusu başına 3-4 mL doldurun. HIV-1 ile inkübasyonun ardından, tüp(ler)deki tüm virüs preparatlarını bir pipet kullanarak dezenfektan solüsyonu içeren bir kaba atın. Eksplantları forseps kullanarak PBS içeren 6 oyuklu plakaya aktarın.
10. Eksplantların RT'de 1 dakika PBS'de dinlenmesine izin verin ve ardından PBS'yi 2-3 kez kuyuya hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın. PBS'yi bir pipet kullanarak dezenfektan solüsyonu içeren bir kaba atın. Her kuyucuğa 3-4 mL yeni PBS ekleyin. Toplam üç yıkama için iki kez daha tekrarlayın. Doku kurumasını önlemek için eksplantları süngerlere aktarmadan hemen önce PBS'yi atın.
    not: Servikal mukozanın ve özellikle endoserviksin eksplantları, enfeksiyon sırasında büyük miktarda mukus salgılar. Mümkün olduğu kadar çok mukusun yıkanması ve uzaklaştırılması çok önemlidir, çünkü eksplantlar üzerinde spesifik olmayan tutma ve ardından virüsün kültür süpernatanına salınması virüs replikasyonunu maskeleyebilir.
11. Forseps kullanarak, 12 oyuklu bir plakada her bir jelatin süngerin üzerine 5-8 eksplant aktarın. Plakayı inkübatöre geri koyun.
12. Tüm biyolojik atıkları, enstitünün tehlikeli biyolojik maddelerin işlenmesine ilişkin yönetmeliklerine ve özel risk değerlendirmesine göre zıt kaplara atın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Jel Köpük 12-7 mm Emilebilir Jelatin Sünger	Pfizer	NDC: 0009-0315-08	Gelfoam ve Spongostan, hem bademcik hem de servikal doku için histoküturda eşit derecede iyi performans gösterir.
SPONGOSTAN Standart 70 × 50 × 10 mm Emilebilir hemostatik jelatin sünger	Ferrosan Tıbbi Cihazlar	MS0002	Gelfoam ve Spongostan, hem bademcik hem de servikal doku için histoküturda eşit derecede iyi performans gösterir.
Fenol kırmızısı ve glutamin içeren RPMI 1640	ThermoFisher Bilimsel	21875034	Kültür ortamı (CM) yapmak için MEM esansiyel olmayan aminoasitler, sodyum piruvat, gentamisin, amfoterisin B ve FBS% 15 (h/h) RPMI1640 ekleyin.
Steril fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7,4, kalsiyum, magnezyum ve fenol kırmızısı olmadan			Cerrahi örneklerin depolanması ve taşınması için kullanmak. PBS, fizyolojik pH'a sahip başka bir izotonik çözelti ile değiştirilebilir. Kültür ortamı, gece boyunca depolama için en iyisidir.
Steril hücre kültürü dereceli su
% 70 etanol çözeltisi
Biyolojik atık bertarafı için dezenfektan solüsyonu
Steril metal forseps veya cımbız
Steril metal makas
Steril düz tartımlı metal spatula
Steril neşterler ve bıçaklar
6 oyuklu hücre kültürü plakaları
Steril Petri kabı, 100 mm × 20 mm
Hücresiz HIV-1 viral preparat HIV-1BaL	NIH AIDS Reaktif Programı	510	Virüs, birkaç deney gerçekleştirecek kadar büyük bir stok oluşturmak için yayılmalıdır. Aliquote virüsü askıya alınır ve -80 °C'de saklanır. Tekrarlanan dondurma ve çözdürme işlemlerinden kaçının.
Hücresiz HIV-1 viral preparat HIV-1LAI.04	NIH AIDS Reaktif Programı	2522	Virüs, birkaç deney gerçekleştirecek kadar büyük bir stok oluşturmak için yayılmalıdır. Aliquote virüsü askıya alınır ve -80 °C'de saklanır. Tekrarlanan dondurma ve çözdürme işlemlerinden kaçının.
Steril 1.5 ve 2 mL vidalı kapaklı tüpler
37 °C'ye ayarlanmış su banyosu
Biyolojik güvenlik kabini
37 °C, 300 rpm'ye ayarlanmış 1,5 mL tüpler için ısıtma bloklu kuru banyo çalkalayıcı

(İngilizce) adet