$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. HEK-Blue IFN-α/β raportör hücreleri kullanılarak biyoaktif tip-I IFN ölçümü.
Not: Bu hücreler, tamamen aktif bir tip I IFN sinyal yolu elde etmek için HEK293 hücrelerinin insan STAT2 ve IRF9 genleri ile stabil transfeksiyonu ile oluşturulmuştur. Ayrıca, IFN-α/β ile indüklenebilir ISG54 promotörü kontrolü altında salgılanan alkalin fosfataz (SEAP) raportör genini de içerirler. Bu hücrelerin tip-I IFN ile uyarılması, JAK / STAT / ISGF3 yolunu aktive eder ve SEAP üretimini indükler.
- HEK-Blue IFN-α/β hücrelerini DMEM'de %10 FBS ile desteklenmiş halde tutun. Bunları, nihai hacmi 180 μl olan düz tabanlı 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 50.000 hücre yoğunluğunda kaplayın.
- 220 μl PBMC'leri (850.000 hücre / ml'de seyreltilmiş) veya 220 μl plazmositoid dendritik hücreleri (pDC'ler) (100.000 ila 500.000 hücre / ml arasında değişen bir konsantrasyonda) 30 μl enfekte T hücresi ile karıştırın (106 hücre / ml'de seyreltilmiş) U-tabanlı 96 oyuklu bir plakada.
- Ko-kültürleri 37 ° C ve% 5 CO2'de 18-22 saat inkübe edin ve daha sonra bunları V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Her bir oyuğa iki kez 20 μl ko-kültür süpernatan ekleyin. Her plaka ayrıca bir dizi dahili standart kontrol gerektirir (insan IFNα, 100 U/ml ila 2.500 U/ml arasında nihai konsantrasyon). Plakaları 37 ° C ve% 5 CO2'de 18-22 saat inkübe edin.
- Enzimin varlığında pembeden mor/maviye değişen QUANTI-Blue çözeltisini kullanarak alkalin fosfataz aktivitesi seviyelerini belirleyin. Üreticinin tavsiyelerine göre QUANTI-Blue'yu hazırlayın. Düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bu çözeltiden 180 μl ekleyin. Her bir oyuğa ayrıca 20 μl indüklenmiş HEK-Blue IFN-α/β hücre süpernatanları ekleyin ve plakayı standart IFN kontrol kuyucuklarında renk oluşana kadar 37 °C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
- 620-655 nm'de bir spektrofotometre kullanarak SEAP seviyelerini değerlendirin ve IFN standart eğrisinin doğrusal kısmından ekstrapolasyon yaparak tip-I IFN konsantrasyonunu belirleyin.