Bir memeli sistemi aracılığıyla influenza virüsü benzeri parçacıkların üretilmesi için bir teknik

Özet

Kaynak: Arevalo, M. T., et al.Aşılama için Virüs Benzeri Partiküllerin İfadesi ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, bir memeli sisteminde grip virüsü benzeri parçacıkların (VLP'ler) oluşumunu göstermektedir. Uygun memeli konakçı hücrelerinde farklı viral yapısal proteinleri kodlayan üç ökaryotik ekspresyon vektörünün eksprese edilmesinin ardından, eksprese edilen viral proteinler, konakçı plazma zarı üzerinde VLP'lere kendi kendine birleşir ve hücre yüzeyinden tomurcuklanma yoluyla salınır.

Protokol

>1. İnfluenza H3N2 VLP Üretimi için Memeli Ekspresyon Sistemi

1. Viral yapısal glikoproteinler hemaglutinin (HA), nöraminidaz (NA) ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) Gag (gruba özgü antijen) p55'i daha önce tarif edilen pTR600 gibi ökaryotik ekspresyon vektörlerine alt klonlayın.
2. Kimyasal olarak yetkin Escherichia coli'de (örneğin, DH5α) DNA'yı amplifiye edin ve üreticinin talimatlarına göre bir plazmit saflaştırma kiti kullanarak transfeksiyon dereceli plazmiti izole edin. DNA miktarı verime ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlıdır.
3. Nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 CO₂ ile 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren büyüme ortamında memeli hücre hattı 293T'yi koruyun.
4. Hücreleri, bir T-150 doku kültürü şişesi, şişe başına 45-75 x 10⁶ hücre içerecek şekilde büyütün, böylece şişe ertesi gün tam hücre yapışması ve %85-95 hücre birleşmesi elde eder. İstenen birleşme için hücreleri mikroskop altında inceleyin.
   not: Ticari transfeksiyon reaktifleri kullanılırken minimum sitotoksisite ile optimal protein ekspresyonu elde etmek için tipik olarak yüksek hücre yoğunluğu önerilir, ancak aşırı birleşme, hücresel atık yan ürünlerinin birikmesine neden olabilir ve hücre canlılığını azaltabilir.
5. Transfeksiyon gününde, üreticinin tavsiyelerine göre lipozom ve DNA karışımını hazırlayın ve T-150 şişesi başına toplam DNA miktarı 40 μg olan 1: 1: 2 HA: NA: Gag DNA bileşimi ile DNA hücrelerini transfekte edin. DNA ve lipozom çözeltilerini serumsuz transfeksiyon ortamında antibiyotik olmadan, her bir şişenin toplam hacmi 20-30 ml.
   olacak şekilde seyreltin not: Gen yapılarının oranı, kullanıcı optimizasyonu gerektirebilir. Burada gösterilmemiş olmasına rağmen, benzer bir transfeksiyon prosedürü respiratuar sinsityal virüs (RSV) F ve HIV Gag ile 1: 1 oranında gerçekleştirilmiştir. DENV ve CHIKV tek ekspresyonlu plazmitler için, optimal ekspresyon için T-150 şişesi başına toplam 20 μg DNA kullanılır. DNA: transfeksiyon reaktif oranları kullanıcı tarafından optimize edilmiştir. Transfeksiyon yöntemine dayalı olarak önerilen transfeksiyon ortamını kullanın, yani polikatyonik lipid transfeksiyonları fetal sığır serumunun azaltılmasını veya yokluğunu önerir, bu nedenle medya, serum yokluğunda büyümeyi desteklemek için büyüme hormonları ve eser elementler ile desteklenebilir.
6. % 5 CO₂ inkübatörü ile şişeleri 37 ° C'ye geri getirin. 200 ml'lik bir hacim için 9 T-150 şişesi kullanın. Hücreler, VLP hasat gününe kadar bir transfeksiyon kültürü ortamında tutulur.
7. Antijene bağlı olarak transfeksiyondan 72-96 saat sonra veya mikroskobik inceleme ile tahmin edildiği gibi hücre canlılığı% 70-80'e düştüğünde hücrelerden kültür süpernatantını hasat edin. Süpernatanı 50 ml'lik konik tüplere aktarın ve hücreleri hücresel kalıntıları peletlemek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da döndürün.
   Not: 3 günlük süpernatantın önceden ısıtılmış, serumsuz transfeksiyon ortamı ile yapışık hücrelere değiştirilmesi, benzer veya biraz azaltılmış verime sahip ikinci bir VLP lotu verecektir ve kullanıcı tarafından optimize edilmelidir.
8. Süpernatanı havuzlayın ve ultrasantrifüjleme yoluyla çökeltmeden önce 0,22 μm'lik bir gözenek zarından süzün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Plazmid Maxi Kiti	Keçi	12163
DMEM (Ömer Çiçeğ	Hücre Kanalı	10-013
Lipofektamin	Yaşam Teknolojileri	L3000075	Lipofektamin 2000, Lipofektamin 3000
Opti-MEM I	Yaşam Teknolojileri	31985062
Cimarec I 6 çok noktalı karıştırma plakası	ThermoFisher Bilimsel	50094596
Polyclear ultrasantrifüj tüpleri	Seton	7025
0,22 μm vakum filtre üstü (500 mL)	Nalgene Belediyesi	569-0020
Gliserol	Sigma	G5516

adet Serisi