Yöntem makalesi

Böcek hücrelerinde bakulovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak chikungunya virüsü benzeri parçacıkların üretilmesi

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Arevalo, M. T. ve ark., Aşılama için Virüs Benzeri Parçacıkların İfadesi ve Saflaştırılması.J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, virüs benzeri parçacıkların, VLP'lerin, böcek hücrelerinin chikungunya virüsü gen kasetini taşıyan rekombinant bir bakulovirüs ile enfekte edilmesiyle nasıl üretildiğini gösterir. Rekombinant virüs, hücreleri enfekte ederek VLP oluşumuna, montajına ve aşı üretiminde potansiyel kullanım için kültür ortamına salınmasına yol açar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Baculovirus/Insect Cell System Kullanılarak Chikungunya Virüs Benzeri Parçacıklar (VLP) İfadesi

  1. Ticari bir bakulovirüs ekspresyon sistemi kullanarak S-27 suşundan chikungunya virüsü kapsid ve zarf proteinlerini (C-E3-E2-6K-E1) eksprese eden rekombinant bakulovirüs üretin.
  2. Spodoptera frugiperda Sf9 hücrelerini serum içermeyen Sf9 büyüme ortamında 100 U / ml penisilin ve 100 μg / ml streptomisin ile 28 ° C'de kültürleyin. Süspansiyon hücresi büyümesi için döndürücü şişe kültürlerini başlatmak için 3-5 x 105 c / ml kullanın. 2-4 x 106 c / ml hücre yoğunluklarına ulaştıklarında rutin olarak geçiş yapın (her 3-4 günde bir).
  3. Sf9 hücrelerini, çok noktalı bir karıştırıcı plaka sistemi üzerinde 130 rpm'de karıştırılarak eğirme şişelerinde süspansiyon halinde kültürleyin. Uygun havalandırma için, kültür hacimlerini eğirici şişenin hacminin yarısından fazla olmayacak şekilde tutun.
  4. Chikungunya veya CHIK VLP'lerin ekspresyonu için, Sf9 hücrelerini 2 x 106 hücre / ml yoğunlukta rekombinant bakulovirüs ile 1 enfeksiyon çokluğunda enfekte edin ve 28 ° C inkübatöre geri dönün. Tipik olarak, 250 ml Sf9 hücresi içeren bir veya iki eğirme şişesini enfekte edin.
    not: Bu yöntemi kullanmasak da, Sf9 hücreleri bir çalkalayıcı platform kullanılarak 28 ° C'de çalkalayıcı şişelerde kültürlenebilir.
  5. Enfeksiyondan 72-96 saat sonra veya üreticinin protokolüne göre Tripan Mavisi Dışlaması ile belirlendiği gibi hücre canlılığı %70-80'e düştüğünde kültürleri hasat edin.
    not: Hücreler enfekte olduklarında çoğalmaya devam eder ve enfeksiyondan 3 gün sonra (dpi) rekombinant CHIK VLP bakulovirüsü ile enfekte olmuş Sf9 kültürlerinde ~% 80 canlılık vardır. Bakulovirüs ile enfekte olmuş hücreler görünüşte daha büyüktür. Morfoloji ayrıca yuvarlaktan dikdörtgene değişebilir. Bakulovirüs enfeksiyonlarının geç evrelerinde, hücreler parçalanmaya başladı.
  6. Kültürleri doğrudan süspansiyon kültüründen 50 ml'lik konik tüplere aktarın ve hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
  7. Süpernatanları toplayın ve ultrasantrifüjleme yoluyla çökeltmeden önce 0,22 μm'lik bir gözenek zarından süzün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Opti-MEM IYaşam Teknolojileri31985062
Bac-to-Bac Bakulovirus Ekspresyon SistemiYaşam Teknolojileri10359-016
0,22 μm vakum filtre üstü (500 mL)Nalgene Belediyesi569-0020
SF-900 II SFMThermoFisher Bilimsel10902-096
Cimarec I 6 çok noktalı karıştırma plakasıThermoFisher Bilimsel50094596
Serisi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Chikungunya VLP leriSf9 H creleriRekombinant Bakulovir sVLP retimiH cre K lt rS pernatan FiltrasyonuA Geli tirme

İlgili makaleler