Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvanların Taşınması, Enflamasyonun Hazırlanması ve İndüksiyonu
- 16 - 20 g ağırlık aralığında 4 - 6 haftalık erkek fareler kullanın. Not: Fareler daha yaşlı veya daha ağırsa, damarı çevreleyen aşırı yağ bulunur ve mikroskobik gözlemi sınırlar.
- Ameliyattan önce tüm aletleri ve mikroskop masasını sterilize edin.
- Bakteriyel bir iltihabı indüklemek için canlı fareye mikroskopiden 4 saat önce intraperitoneal olarak 20 mg / kg LPS (lipopolisakkarit) enjekte edin.
- Plastik hazneyi ve mezenter dokusunu nemlendirmek için 37 ° C'de bir su banyosunda% 0.9'luk bir tuzlu su çözeltisini önceden ısıtın.
- Mikroskopi işleminden hemen önce fareyi intraperitoneal ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) enjeksiyonu ile uyuşturun. Alternatif anestezi kullanılabilir, ör.% 2 izofluran inhalasyonu. Refleks stimülasyonuna yanıt kaybıyla uygun anesteziyi onaylayın (sıkı basınçla ayak parmağı veya kuyruk tutam).
- Bir tıraş makinesi kullanarak karın bölgesini epilasyon yapın ve gevşek tüyleri% 70 etanol ile doyurulmuş gazlı bezle alın.
- Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farenin gözlerine veteriner merhemi sürün.
2. Cerrahi
- Karnı% 70 etanol kullanarak sterilize edin. Bu yöntem steril bir yöntem değildir ve deneyin sonunda öldürücü olabilir.
- Medyan laparotomi yapın: Küçük, kavisli forseps ve küçük makas kullanarak karın derisini açın. Epigastrik damarları tanımlayın ve damarları korumak için linea alba bölgesindeki peritonu açın.
- Dokuyu nemli tutmak için karın boşluğuna birkaç damla önceden ısıtılmış salin uygulayın.
- Lökositleri ve trombositleri retroorbital olarak 50 μl rodamin 6G (1 mg / ml) enjekte ederek floresan olarak etiketleyin.
- Bir ileum halkasını dıştan çıkarın ve 10 cm çapında bir petri kabına yerleştirin; 37 ° C'de önceden ısıtılmış salin solüsyonunu (% 0.9) her dakika uygulayarak dokuyu nemli tuttuğunuzdan emin olun.
>3. İntravital Mikroskopi
- Fareyi mikroskobun altına yerleştirin ve 200 - 300 μm çapındaki mezenter damarını görüş merkezine getirin. Görünür yağ çevresi olmayan bir damar seçin.
- Mezenter damarlarına dokunmayın, böylece endotelin uyarılmasını önleyin. İleum halkasını dikkatli bir şekilde tutun.
- Mikroskop yazılımı kullanarak ters veya dik bir mikroskop ve bir kamera ile kan hücresi-endotel etkileşimlerini görselleştirin. Fare başına 4 farklı damarda 1 dakika boyunca kan hücresi-endotel etkileşimlerini kaydedin.
- Görüntüleme deneylerinin tamamlanmasından sonra fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın.
>4. Analiz
- Analizi tüm parametreler için çevrimdışı ve kör olarak gerçekleştirin. Herhangi bir uygun yazılım programını kullanarak analiz yapın.
- İntraluminal kan hücresi akışına odaklanan yüksek zaman çözünürlüklü sine-kliplerde (maksimum kare hızı) stabil ve bireyler arası karşılaştırılabilir kan akışı koşullarını doğrulayın.
- Yuvarlanan lökositlerin sayısını ölçün. Bu nedenle damar boyunca dikey bir çizgi çizin ve bu çizgiyi geçen tüm lökositleri 1 dakika içinde sayın.
- Tek bir lökositin endotel üzerinde stabil bir şekilde yuvarlanırken 50 μm'lik bir mesafeyi geçmesi için gereken süreyi ölçerek yuvarlanma hızını belirleyin. Bunu yapmak için, damar boyunca 50 μm mesafede iki dikey çizgi çizin.
- Temsili bir lökositin bir satırdan diğerine geçmesi için gereken süreyi ölçün. Gereken süreye (μm/s) 50 μm'yi bölerek lökositlerin hızını hesaplayın.
- 0,04 mm'lik bir alanda lökosit yapışmasını ölçün2. Bunu yapmak için, damarın içine kenar uzunluğu 200 μm olan bir kare çizin.
- Bu kare içinde 30 saniye boyunca görünür bir hareket olmaması olarak tanımlanan sıkı yapışık lökositleri sayın.
- Trombosit-lökosit etkileşimlerini ölçmek için bir lökosit'e bağlı trombositlerin sayısını sayın.
