$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Deri altı enjeksiyon için antijen preparasyonu
- Mycobacterium tuberculosis, Mtb H37Ra tozu ile solunmasını veya cilt temasını önlemek için bu bölümdeki tüm prosedürleri kimyasal bir çeker ocak içinde gerçekleştirin. Complete Freund's Adjuvant (tipik olarak BSL-1) için kurumsal politikalarınıza göre ele alın. Bu, kimyasallara dayanıklı eldivenler, koruyucu gözlükler ve koruyucu iş kıyafetleri (laboratuvar önlüğü) kullanmayı içerir.
- Deney hayvanlarına verilecek reaktiflerin kontaminasyonunu önlemek için iyi bir steril teknik kullanın.
- 5 mg liyofilize, ısıyla öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis H37Ra tozunu 5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 2.5 mL soğuk PBS ile karıştırarak fosfat tamponlu salin (PBS) içinde Mtb süspansiyonunu yapın. 30 saniye boyunca bir kez girdap yapın ve ardından buzun üzerine yerleştirin.
- PBS'de H37Ra'nın ince bir süspansiyonunu oluşturmak için, süspansiyonu 5 dakika boyunca buz üzerinde sonikasyon yapın.
- Dönüştürücü ünitesinin gövdesini açınamp ve probu %70 (h/h) alkollü çubukla temizleyin.
- Sonikatörü açın, güç kontrol düğmesini çevirerek güç ayarını 4'e ayarlayın ve probun ucunu PBS içeren mikobakteriyel toza daldırın. Prob ucunun numunenin derinliğinin en az yarısına kadar daldırıldığından ve prob ucunun mikrosantrifüj tüpünün duvarına temas etmediğinden emin olun.
- Karışımı 30 saniye boyunca buz üzerinde sonikasyona tabi tutun, 30 saniye duraklayın ve sıvıyı ısıtmadan tozu eşit bir süspansiyona tamamen dağıtmak için toplam 5 dakika tekrarlayın.
- Karışıma 2.5 mL Freund'un Eksik Adjuvanı ekleyin ve emülsiyon diş macunu benzeri bir kıvam oluşturana kadar buz üzerinde sonikasyon işlemini tekrarlayın.
- Kontrol düğmesini kullanarak gücü 0'a ayarlayın ve sonikasyonu sonlandırmak için üniteyi kapatın. Ucu süspansiyondan çıkarın ve probu alkollü bir bezle silin.
- Antijen emülsiyonunu 4 °C'de saklayın. Emülsiyonun partilerini yapmak, deneyler arasında tutarlılığın sağlanmasına yardımcı olacaktır. Emülsiyon 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.
2. Deri altı enjeksiyon
- İntravitreal enjeksiyondan bir hafta önce deri altı enjeksiyonu yapın (-7. gün olarak belirlenmiştir).
- Mikobakteriyel emülsiyonu ile 1 mL'lik bir şırınga (iğne takılı değil) yükleyin. Emülsiyonun viskozitesi ve opaklığı nedeniyle, görülmesi zor hava kabarcıkları şırıngayı doldurabilir.
- Şırıngadaki hava kabarcıklarını önlemek için, 0.2-0.3 mL emülsiyon yükledikten sonra, şırıngayı ters çevirin (ucu yukarı bakacak şekilde) ve kabarcıkları yüzeye çıkarmak için şırıngayı bir tezgahın kenarına tekrar tekrar hafifçe vurun.
- Şırıngadaki havayı boşaltın ve şırıngayı doldurmaya devam edin. Ters çevirin ve dolana kadar aralıklı olarak hafifçe vurun.
- Şırınganın üzerine 25 G'lik bir iğne yerleştirin ve iğneyi doldurmak için emülsiyonu ilerletin. Şırıngayı kullanılana kadar buz üzerinde saklayın.
- Deri altı enjeksiyonu güvenli bir şekilde gerçekleştirmek için, fareyi uyuşturun veya hayvanın arka kısmına kolay erişim sağlayan insancıl kısıtlama yöntemlerini kullanın.
- Deri altı enjeksiyon için anestezi yapmak için, hayvanı bir izofluran indüksiyon odasına yerleştirin (indüksiyon için% 3 -% 4 ve% 1 -% 3). Anestezi uygulandıktan sonra, farenin yavaş bir solunum hızına sahip olduğundan ve solunum sıkıntısı belirtisi göstermediğinden emin olun.
- Deri altı enjeksiyonları ya kalçaların dorsal yüzeyine ya da kasık lenf düğümlerinin bölgesine proksimal, bacakların ventral yüzeyine yerleştirin.
- Kas içine enjekte edilmesini önlemek için iğneyi dikkatlice yerleştirin. Deri altı boşluğa 0.05 mL Mtb emülsiyonu enjekte edin. Kalın emülsiyonun tam olarak enjekte edilmesini sağlamak için iğneyi hemen çıkarmayın.
- Hayvan başına toplam 0.1 mL olacak şekilde enjeksiyonu hem sol hem de sağ tarafta tekrarlayın.
- Anestezi uygulanırsa, tamamen iyileşene kadar fareyi ılık bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın.
- Tamamen iyileştikten sonra fareyi kafesine geri koyun ve kafes kartını deri altı enjeksiyon tarihi ile etiketleyin.
- Oral asetaminofen (200 mg / kg / gün) ile analjezi sağlayın, ancak anti-enflamatuar ajanlar üveit indüksiyonunu etkileyebileceğinden steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (NSAID'ler) sağlamayın.